組蛋白去甲基酶 4 (KDM4) 的成員 (members) 是由 KDM4AKDM4D KDM4D KDM4D所組 成，是屬於含有 Jumonji C功能域 (domain) 的組蛋白去甲基酶 ，會以 Fe(II)與 α-酮戊二酸 (α-KG) 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 為輔酶進行組蛋白 (histone) 的去甲基化反應 ，並在癌細 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 胞中扮演調控表關遺傳的腳色。在組蛋白去甲基酶 4 (KDM4)的成員中， KDM4AC已被指出大量表現於許多癌症中，例如 已被指出大量表現於許多癌症中，例如 已被指出大量表現於許多癌症中，例如 :乳癌、腸與前列腺。除 乳癌、腸與前列腺。除 乳癌、腸與前列腺。除 乳癌、腸與前列腺。除 乳癌、腸與前列腺。除 乳癌、腸與前列腺。除 此之外， KDM4AC是雄性激素受體 (androgen receptor，AR)的共激活因子 的共激活因子 的共激活因子 的共激活因子 的共激活因子 的共激活因子 (coactivator) 使調控 AR下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 下游基因表現。在之前的實驗中，我們已經解出 KDM4B的結構並認為 的結構並認為 KDM4B有希望成為標靶治療的目。敲減 有希望成為標靶治療的目。敲減 有希望成為標靶治療的目。敲減 有希望成為標靶治療的目。敲減 (knockdown) KDM4A與 KDM4B的量會造成雄性激素依賴型細胞株 (LNCaP) 增生速率 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 變慢以及導致細胞凋亡。我們也發現了一個化合物 M2，其針對 KDM4B的 IC50為 12.2 M。在這裡的研究中，我們發現異種移植老鼠模式 。在這裡的研究中，我們發現異種移植老鼠模式 。在這裡的研究中，我們發現異種移植老鼠模式 。在這裡的研究中，我們發現異種移植老鼠模式 。在這裡的研究中，我們發現異種移植老鼠模式 (xenograft mouse model) 中， M2會稍微降低腫瘤的生長 。雖然結果不具有顯著差異，這 雖然結果不具有顯著差異，這 雖然結果不具有顯著差異，這 雖然結果不具有顯著差異，這 很有可能是因為 M2在體內的 半衰期很短所造成。並將 。並將 M2結構分成兩個部 分， 3,5,7-dihydroxy-chromen-4-one與 3,4,5-trihydroxy-benzene並各別尋找類似 並各別尋找類似 物抑制 KDM4B活性，我們分別找到了有效抑制劑 D1與 D2。 D1與 D2會專 一性抑制 KDM4AC而不是 KDM6A與 PHF8。值得注意的是， D1與 D2會 抑制雄激素非 抑制雄激素非 抑制雄激素非 抑制雄激素非 抑制雄激素非 抑制雄激素非 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 依賴型的細胞株增生 (各別的 各別的 各別的 IC50是 C4-2B = 17.6 M, M, CWR22Rv1 = 10.4 M 與 C4-2B = 11.5 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M, CWR22Rv1 = 13.2 M). D2具有專 一性抑制癌症細胞增生並且不正常的。以電腦模擬分析顯示雜合 一性抑制癌症細胞增生並且不正常的。以電腦模擬分析顯示雜合 一性抑制癌症細胞增生並且不正常的。以電腦模擬分析顯示雜合 一性抑制癌症細胞增生並且不正常的。以電腦模擬分析顯示雜合 的 D1-D2化合物會具有更好的 親和力，這也提供新片段基礎方式去了發掘 新型的 KDM4抑制劑。

Histone lysine-specific demethylase 4 members (KDM4AD) that belong to the Jumonji C domain Fe(II) oxoglutarate proteins catalyze the histone demethylation reaction are key epigenetic regulators in cancer cells. Among KDM4 members, KDM4A-C are overexpressed in several types of cancers including breast cancer, colon cancer and prostate cancer. Moreover, KDM4A-C is a coactivator of androgen receptor (AR) that regulates AR responsive genes. KDM4B is found to affect AR turnover rate involved in prostate cancer progression. We have previously determined KDM4B structure and identified KDM4 as a promising therapeutic target. Knockdown of KDM4A or KDM4B reduces cells proliferation and increases apoptosis in AR-dependent LNCaP cells. We have also identified a compound M2 with IC50 = 12.2 ± 1.6 μM. In this study, we show that M2 slightly reduced tumor growth in xenografts, despite no statistical significance, possibly due to the short half-lives of flavonoids in serum. Two M2-based fragmented moieties (3,5,7-dihydroxy-chromen-4-one and 3,4,5-trihydroxy-benzene) were utilized respectively to screen for analogues with higher potency. D1 and D2 that exhibited selective inhibition against KDM4A-C but not KDM6A and PHF8 were identified. Notably, D1 and D2 blocked the cell proliferation in AR-independent cells (C4-2B, IC50 = 17.6 μM, CWR22Rv1 = 10.4 μM and C4-2B IC50 = 11.5 μM, CWR22Rv1 = 13.2 μM, respectively). D2 selectively inhibited prostate cancer cells but not normal cells. Computer simulation analysis reveals hybrided-D1-D2 compounds have a superior binding affinity, which provides a new fragment-based approach to discover novel KDM4 inhibitor.

致謝 ............................................................................................................................................ i
摘要 ........................................................................................................................................... ii
Abstract .................................................................................................................................... iii
目錄 .......................................................................................................................................... iv 1.介紹 ........................................................................................................................................ 1
1.1表關遺傳 （Epigenetics） ............................................................................................ 1
1.2組蛋白的修飾 （Histone modification） ..................................................................... 1
1.3 組蛋白甲基化 ................................................................................................................ 3
1.4組蛋白去甲基酶 ............................................................................................................. 4
1.5 人類去甲基酶KDM4 （Lysine （K）-specific demethylase 4） ............................ 4
1.6癌症與KDM4的關係 .................................................................................................... 5
1.6.1前列腺癌與KDM4的關係 ..................................................................................... 6
1.7前列腺癌（prostate cancer）與治療方式 ..................................................................... 7
1.8片段基礎前導物搜索 （Fragment-based lead discovery） ......................................... 8
1.9實驗目的 ......................................................................................................................... 8
2.材料與方法 ............................................................................................................................ 9
2.1克隆 （cloning） 人類去甲基酶KDM4A-C、KDM6A和PHF8............................. 9
2.2大腸桿菌 （E. Coli） 表現系統表現人類去甲基酶KDM4A-C、KDM6A和PHF8 ............................................................................................................................................... 9
2.3人類去甲基酶KDM4A-C、KDM6A和PHF8的純化 ............................................. 10
2.4蛋白質的濃縮及凝膠過濾層析 （Gel filtration chromatography） ......................... 10
2.5測定蛋白質濃度 ........................................................................................................... 11
2.6 體外（In Vitro）人類去甲基酶活性測試 .................................................................. 11
2.7 結合甲醛脫氫酶（FDH-Coupled）的人類去甲酶抑制劑快篩分析 ....................... 12
2.8 甲醛脫氫酶抑制性測試 .............................................................................................. 13
2.9針對人類去甲基酶的半抑制濃度（IC50）測定 ....................................................... 13
2.10 分析D1和D2針對KDM4B的抑制型態 .............................................................. 14
2.11 以微量熱泳動儀（microscale thermophoresis, MST）測定抑制劑的親和性 ....... 14
2.12以電腦模擬針對KDM4B的口袋（pocket）對接（Docking） D1和D2 ........... 15
2.13細胞的培養 ................................................................................................................. 15
2.14細胞毒殺測試（MTT assay） ................................................................................... 15
2.15細胞內甲基化程度分析 ............................................................................................. 16
2.16軟瓊脂分析（Soft agar assay） ................................................................................. 16
2.17裸鼠的異種移植模式（Xenograft Model） .............................................................. 17
3.結果 ...................................................................................................................................... 18
3.1 M2對異種移植老鼠的成效 ......................................................................................... 18
3.2 以M2為骨幹篩選有效之抑制劑 ............................................................................... 18
3.2.2 篩選A區抑制劑 .................................................................................................. 19
3.2.1 篩選B區抑制劑 .................................................................................................. 19
3.2.3 反向測試甲醛脫氫酶的抑制性 ........................................................................... 20
3.2.4 測試化合物的半抑制濃度（IC50） ................................................................... 20
3.2.5 結構與活性關係 （structure-activity relationship） 分析 ................................ 20
3.2.5 體外組蛋白去甲基化分析 ................................................................................... 22
3.2.6 以微量熱泳動 （microscale thermophoresis） 分析D2的親和性 ................. 22
3.2.7 D1和D2的專一性分析 ....................................................................................... 22
3.2.8 D1及D2抑制型酵素動學分析與以電腦模擬進行化合物衍生 ........................ 23
3.3 D1與D2對細胞毒性（Cytotoxicity）以及細胞內組蛋白甲基化分析分析 ........... 24
3.3.1 M2與D1對前列腺癌細胞致瘤性 （Tumorigenicity） 分析 .......................... 25
4.討論與總結 .......................................................................................................................... 26
4.1 改進M2之配方 .......................................................................................................... 26
4.2 片段基礎的前導物搜索（Fragment-based lead discovery） .................................... 26
4.3 D1、D2與M2對前列腺癌細胞的影響 ..................................................................... 27
4.4總結 .............................................................................................................................. 28
5.參考資料 .............................................................................................................................. 29
表一、A區類似物 ................................................................................................................. 33
表二、B區類似物 ................................................................................................................. 38
表三、D1與D2針對KDM4A－C、KDM6A與PHF8半抑制濃度（IC50）分析 ........ 46
圖一、動物實驗時間軸 ......................................................................................................... 47
圖二、M2給藥對腫瘤生長之影響 ....................................................................................... 48
圖三、以部分M2作為骨架去找尋類似物 .......................................................................... 49
圖四、結合甲醛脫氫酶去甲基化分析法的機制 ................................................................. 50
圖五、純化KDM4A－C、KDM6A與PHF8 ................................................................................ 51
圖六、以結合甲醛脫氫酶（FDH-Coupled）人類去甲酶抑制劑快篩分析快篩A結構類似物 ......................................................................................................................................... 52
圖七、以結合甲醛脫氫酶（FDH-Coupled）人類去甲酶抑制劑快篩分析快篩B結構類似物 ............................................................................................................................................. 53
圖八、甲醛脫氫酶抑制性測試 ............................................................................................. 54
圖九、A區與B區結構類似物的半抑制濃度分析 ............................................................. 55
圖十、D1與D1類似物之結構與活性分析 ........................................................................ 56
圖十一、B區類似物遮蔽效應分析 ..................................................................................... 57
圖十二、體外組蛋白去甲基化分析 ..................................................................................... 58
圖十三、MST作用原理 ........................................................................................................ 59
圖十四、以MST分析D2針對KDM4B的親和性 ............................................................ 60
圖十五、以酵素動力學分析D1與D2的抑制型態 ........................................................... 61
圖十六、依模擬分析去衍生D2 ........................................................................................... 62
圖十七、以結合甲醛脫氫酶人類去甲基酶活性測試分析D2衍生物 .............................. 63
圖十八、電腦輔助模擬連接片段分子 ................................................................................. 64
圖十九、D1與D2的細胞毒性（cytotoxicity）分析 ......................................................... 65
圖二十、細胞內組蛋白甲基狀態的分析 ............................................................................. 66
圖二十一、M2與D1對前列腺癌細胞形成群體(colony formation)分析 .......................... 67

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