有鑒於現代生物與醫學研究發展，光學生物感測器展現了巨大的成長潛力，尤其是螢光型生物感測器，以快速、靈敏、即時動態監控等優點備受關注。各種螢光基團與不同螢光放射機制開發的感測器不斷推陳出新。其中非常引人注目的就是籠閉螢光基團(caged fluorophore)系列，此系列已開發出實際應用的反應型籠閉羅丹明(caged-rhodamine)。但籠閉生物素(caged-biotin)沒有任何外顯訊號顯示來源，使得籠閉生物素的設計應用無法擴展。在本研究中，我們結合SBD環境敏感螢光基團，利用生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)專一性結合的特點，成功開發出反應型的籠閉生物素螢光探針模型。我們同時能夠應用此模型偵測硝基還原酶(nitroreductase)、聯氨(hydrazine)與酯解酶(esterase)。
以SBD環境敏感螢光基團，我們亦開發MGMT蛋白質的增益型螢光探針。 MGMT的含量多寡與烷基化藥物的耐藥性有關，是化療過程中的重要指標，但MGMT與辨識端間的反應作用不會影響探針本身構造，我們無法使用傳統或是籠閉生物素模型的探針設計，所以開發MGMT的探針具有一定的挑戰性。結合MGMT假性受質O6-BG，並藉由SBD環境敏感的特點，發展出MGMT螢光增益探針。本論文中，我們利用SBD螢光基團在親水與疏水性環境中螢光訊號增益的效果，成功開發出兩種新穎的偵測模式，並相信未來能夠能再被延伸用於偵測其他重要物質並有所幫助。 

Recently, the development and applications of small molecule-based fluorescent probes for analyte detection have obtained much attention. Typically, a fluorophore is caged with an analyte recognition group to attenuate the fluorescence. In the presence of target molecule, the fluorophore is uncaged to induce a large fluorescence enhancement. In this thesis, we introduce a novel sensing mechanism based on caged biotin for analyte detection. The caged biotin is attached with an environment-sensitive fluorophore SBD and an analyte recognition group. Upon uncaging with the target molecule, the biotin-SBD probe is transferred to the avidin protein to emit stronger fluorescence. We have demonstrated this approach for the detection of nitroreductase, hydrazine and esterase. In addition, we have also used SBD dye to construct a MGMT-activated fluorescence probe. MGMT protein is a very useful prognostic marker to provide a guide for therapeutic decisions. We successfully designed this fluorogenic probe which consists of a specific MGMT suicide pseudosubstrate, O6-benzylguanine and SBD. We believe that these two fluorescence activation design based on SBD can also be extended to detect other important molecules.

摘要 i
Abstract ii
謝誌 iii
著作列表 iv
目錄 v
縮寫對照表 ix
第一章 緒論 1
1-1前言 1
1-2 生物感測器 1
1-2.1生物辨識元件 2
1-2.2轉換元件 3
1-3螢光增益機制 8
1-3.1自組裝與自解離 (self-Assembly/ disassembly) 8
1-3.2聚集放光 (aggregation-induced emission, AIE) 9
1-3.3環境敏感螢光增益機制 10
Part 1. 14
第二章 文獻回顧 15
2-1傳統的籠閉螢光探針(caged-fluorescence probe) 15
2-1.1籠閉螢光黃(caged-fluorescein): 15
2-1.2籠閉羅丹明(caged-rhodamine): 17
2-2反應型籠閉螢光探針(reactive caged-fluorescence probe) 18
2-3籠閉型非螢光探針 20
2-3.1籠閉螢光素(caged-luciferin) 21
2-3.2籠閉生物素(caged-biotin) 24
第三章 探針設計與構想 26
3-1 設計構想與螢光分子的選擇 26
3-2 探針設計 28
第四章 結果與討論 30
4-1 硝基還原酶螢光探針性質測試 30
4-2 模型應用於小分子聯氨偵測 37
4-3 設計應用環化(cyclization)脫離之籠閉生物素模型 41
4-4 應用三甲基鎖設計偵測酯解酶之模型 47
4-5 實驗結論 51
Part 2. 52
第五章 文獻回顧 53
5-1 O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT) 53
5-2 MGMT之分析方法 54
5-2.1甲基特異PCR (methylation-specific PCR, MSP) 54
5-2.2 免疫組織化學染色法 (immunohistochemistry, IHC) 57
5-2.3 小分子探針偵測 60
第六章 螢光探針設計構想 66
6-1 螢光探針設計構想 66
第七章 結果與討論 68
7-1 螢光探針性質測試 68
7-2動力學分析及水解反應測試 74
7-3 細胞實驗 77
7-4 實驗結論 80
第八章 論文總結 81
第九章 實驗部分 82
9-1實驗藥品及器材 82
9-2 有機合成與光譜資料 84
9-3 動力學測試 114
9-4 螢光測試條件 116
9-5 蛋白質表現及純化 117
9-5.1 蛋白質表現 117
9-5.2 蛋白質純化 118
9-5.3 SDS-膠體電泳 (SDS-PAGE) 119
9-6 細胞培養及細胞影像實驗 120
9-6.1 培養基及試劑 120
9-6.2 細胞繼代培養 121
9-6.3 細胞轉染 (cell transfection) 121
9-6.4 細胞影像 122
9-6.5 細胞裂解液 (cell lysates) 偵測 122
9-6.6 西方點墨法 (western blot) 123
參考文獻 125
附錄 132

1. Clark, L. C.; Lyons, C. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1962, 102, 29.
2. Thevenot, D. R.; Toth K.; Durst, R. A.; Wilson G. S. Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 121.
3. 蘇宏基, 化學生物感測器講義, 國立東華大學化學系
4. Grieshaber D.; MacKenzie R.; Voros J.; Reimhult E. Sensors 2008, 8, 1400.
5. Chan J.; Dodani S. C.; Chang C. J. Nat. Chem. 2012, 4, 973.
6. Wen, C.-Y.; Hu, J.; Zhang, Z.-L.; Tian, Z.-Q.; Ou, G.-P.; Liao, Y.-L.; Li, Y.; Xie, M.; Sun, Z.-Y.; Pang, D.-W. Anal.Chem. 2013, 85, 1223.
7. Patel, P. N.; Mishra, V.; Mandloi, A. S. JERS. 2010, 1, 15.
8. Long, F.; Zhu, A.; Shi, H. Sensors 2013, 13, 13928.
9. Deal, K. S.; Easley, C. J. Anal.Chem. 2012, 84, 1510.
10. Jindal, R.; Cramer, S. M. J. Chromatogr. A 2004, 1044, 277.
11. Tan, H.-Y.; Loke, W.-K.; Tan, Y.-T.; Nguyen, N.-T. Lab Chip 2008, 8, 885.
12. Nguyen, H. H.; Park, J.; Kang, S.; Kim, M. Sensors 2015, 15, 10481.
13. Sipova, H.; Homola, J. Anal. Chim. Acta 2013, 773, 9.
14. Liedberg, B.; Nylander, C.; Lundstorm, I. Sens. Actuators, A 1983, 4, 299.
15. Liedberg, B.; Nylander, C.; Lundstorm, I. Biosens. Bioelectron.1995, 10, i.
16. Brennan, J. D. (2006) Encyclopedia of Analytical Chemistry. John Wiley & Sons, Ltd.
17. Nagano, T. Proc. Jpn. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 2010, 86, 837.
18. Yoshii, T.; Mizusawa, K.; Takaoka, Y.; Hamachi, I. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 16635.
19. Ogawa, M.; Kosaka, N.; Choyke, P. L.; Kobayashi, H. ACS Chem. Biol. 2009, 4, 535.
20. Hong, Y.; Lam, J. W. Y.; Tang, B. Z. Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 5361.
21. Wang, X.; Hu, J.; Liu, T.; Zhang, G.; Liu, S. J. Mater. Chem. 2012, 22, 8622.
22. Rotkiewicz, K.; Grellmann, K. H.; Grabowski, Z. R. Chem. Phys. Lett. 1973, 19, 315.
23. Mustafic, A.; Huang, H.-M.; Theodorakis, E. A.; Haidekker, M. A. J. Fluoresc. 2010, 20, 1087.
24. Drummen, G. P. C. Molecules 2012, 17, 14067.
25. Wu, Y.-Y.; Yu, W.-T.; Hou, T.-C.; Liu, T.-K.; Huang, C.-L.; Chen, I.-C.; Tan, K.-T. Chem. Commun. 2014, 50, 11507.
26. Loving, G. S.; Sainlos, M.; Imperiali, B. Trends Biotechnol. 2010, 28, 73.
27. Moreno, F.; Cortijo, M.; Gonzalez-Jimenez, J. J. Photochem. Photobiol. 1999, 69, 8.
28. 莊鈺德,可選擇性的進行蛋白質與磺胺類藥物檢測之對環境敏感螢光探針,
國立清華大學碩士論文, 2013.
29. Chen, R. F. Arch. Biochem. Biophys. 1967, 120, 609.
30. Liu, T.-K.; Hsieh, P.-Y.; Zhuang, Y.-D.; Hsia, C.-Y.; Huang, C.-L.; Lai, S.-P.; Lin, H.-S.; Chen, I.-C.; Hsu, H.-Y.; Tan, K.-T. ACS Chem. Biol. 2014, 9, 2359.
31. Belov, V. N.; Wurm, C. A.; Boyarskiy, V. P.; Jakobs, S.; Hell, S. W. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 3520.
32. Krafft, G. A.; Sutton, W. R.; Cummings, R. T. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 301.
33. Politz, J. C. Trends Cell Biol. 1999, 9, 284.
34. Kobayashi, T.; Urano, Y.; Kamiya, M.; Ueno. T.; Kojima, H.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 6696.
35. Gee, K. R.; Weinberg, E. S.; Kozlowski, D.J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2181.
36. Johnson, I.; Spence M. T. Z. (2010) Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Edition.
37. Dujols, V.; Ford, F.; Czarnik, A. W. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7386.
38. Lim, S.-Y.; Yoon, D.-H.; Ha, D. Y.; Ahn, J. M.; Kim, D. I.; Kown, H.; Ha, H.-J.; Kim, H.-J. Sens. Actuators, B 2013, 188,111.
39. Sakabe, M.; Terai, T.; Nagano, T.; Urano, Y.; J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 409.
40. Shao, Q.; Jiang, T.; Ren, G.; Cheng, Z.; Xing, B. Chem. Commun. 2009, 4028.
41. Li, J.; Chen, L.; Du, L.; Li, M. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 662
42. Bittner, G. C. V.; Dubikovskaya, E. A.; Bertozzi, C. R.; Chang, C. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 21316.
43. Terai, T.; Maki, E.; Sugiyama, S.; Takahashi, Y.; Matsumura, H.; Mori, Y.; Nagano, T. Chem. Biol. 2011, 18, 1261.
44. Hama, Y.; Urano, Y.; Koyama, Y.; Kamiya, M.; Bernardo, M.; Paik, R. S.; Shin, I. S.; Paik, C. H.; Choyke, P. L.; Kobayashi, H. Cancer Res. 2007, 67, 2791.
45. Bhuniya, S.; Maiti, S.; Kim, E.-J.; Lee, H.; Sessler, J. L.; Hong, K. S.; Kim, J. S. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 4469.
46. Chen, Y.; Hong, P.; Xu, B.; He, Z.; Zhou, B. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 2014, 122, 441.
47. Uchiyama, S.; Kimura, K.; Gota, C.; Okabe, K.; Kawamoto, K.; Inada, N.; Yoshihara, T.; Tobita, S. Chemistry 2012, 18, 9552.
48. Li, Y.; Sun. Y.; Li, J.; Su, Q.; Yuan, W.; Dai, Y.; Han, C.; Wang, Q.; Feng, W.; Li, F. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 6407.
49. Cui, L.; Zhong, Y.; Zhu, W.; Xu, Y.; Du, Q.; Wang, X.; Qian, X.; Xiao, Y. Org. Lett. 2011, 13, 928.
50. Kim, S.-W.; Cho, I.-H.; Park, J.-N.; Seo, S.-M.; Paek, S.-H. Sensors 2016, 16, 669.
51. Zhou, J.; Shi, W.; Li, L.-H.; Gong, Q.-Y.; Wu, X.-F.; Li, X.-H.; Ma, H.-M. Chem. Asian J. 2016, ASAP.
52. Li, Z.; Li, X.; Gao, X.; Zhang, Y.; Shi, W.; Ma, H. Anal. Chem. 2013, 85, 3926.
53. Zhang, J.; Liu, H.-W.; Hu, X.-X.; Li, J.; Liang, L.-H.; Zhang, X.-B.; Tan, W. Anal. Chem. 2015, 87, 11832.
54. Choi, M. G.; Moon, J. O.; Bae, J.; Lee, J. W.; Chang, S.-K. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 2961.
55. Li, K.; Xu, H.-R.; Yu, K.-K.; Hou, J.-T.; Yu, X.-Q. Anal. Methods 2013, 5, 2653.
56. Wang, F.; Zhou, L.; Zhao, C.; Wang, R.; Fei, Q.; Luo, S.; Guo, Z.; Tian, H.; Zhu, W.-H. Chem. Sci. 2015. 6. 2584.
57. Yang, X.; Guo, Y.; Strongin, R. M. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 2739.
58. Liu, Y.; Yu, D.; Ding, S.; Xiao, Q.; Guo, J.; Feng, G. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6, 17543
59. Gorska, K.; Manicardi, A.; Barluenga, S.; Winssinger, N. Chem. Commun. 2011, 47, 4364.
60. Gomes, P.; Vale, N.; Moreira, R. Molecules 2007, 12, 2484.
61. Milstein, S.; Cohen, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1970, 67, 1143.
62. Levine, M. N.; Raines, R. T. Chem. Sci. 2012, 3, 2412.
63. Liu, R.; Aw, J.; Teo, W.; Padmanabhan, P.; Xing, B. New J. Chem. 2010, 34, 594.
64. Mishina, Y.; Duguid, E. M.; He, C. Chem. Rev. 2006, 106, 215.
65. Gerson, S. L. Nat. Rev. Cancer 2004, 4, 296.
66. Pegg, A. E. Mutat. Res. 2000, 462, 83.
67. Schold, S. C., Jr.; Brent, T. P.; von Hofe, E.; Friedman, H. S.; Mitra, S.; Bigner, D. D.; Swenberg, J. A.; Kleihues, P. J. Neurosurg. 1989, 70, 573.
68. Middlemas, D. S.; Stewart, C. F.; Kirstein, M. N.; Poquette,C.; Friedman, H. S.; Houghton, P. J.; Brent, T. P. Clin. Cancer Res. 2000, 6, 998.
69. Brent, T. P.; Houghton, P. J.; Houghton, J. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 2985.
70. Becker, K.; Dosch, J.; Gregel, C. M.; Martin, B. A.; Kaina, B. Cancer Res. 1996, 56, 3244.
71. Ragg, S.; Xu-Welliver, M.; Bailey, J.; D'Souza, M.; Cooper, R.; Chandra, S.; Seshadri, R.; Pegg, A. E.; Williams, D. A. Cancer Res. 2000, 60, 5187.
72. Hegi, M. E.; Diserens, A.-C.; Gorlia, T.; Hamou, M.-F.; de Tribolet, N.;
Weller, M.; Kros, J. M.; Hainfellner, J. A.; Mason, W.; Mariani, L.; Bromberg, J. E. ; Hau, P.; Mirimanoff, R. O.; Cairncross, J. G.; Janzer, R. C.; Stupp, R. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 997.
73. Hegi, M. E.; Liu, L.; Herman, J. G.; Stupp, R.; Wick, W.; Weller, M.; Mehta, M. P.; Gilbert, M. R. J. Clin. Oncol. 2008, 26, 4189.
74. Weller, M.; Stupp, R.; Reifenberger, G.; Brandes, A. A.; van den Bent, M. J.; Wick, W.; Hegi, M. E. Nat. Rev. Neurol. 2010, 6, 39.
75. Madhusudan, S.; Middleton, M. R. Cancer Treat. Rev. 2005, 31, 603.
76. Christmann, M.; Verbeek, B.; Roos, W. P.; Kaina, B. Biochim. Biophys. Acta 2011, 1816, 179.
77. Esteller, M.; Hamilton, S. R.; Burger, P. C.; Baylin, S. B.; Herman, J. G. Cancer Res. 1999, 59, 793.
78. Herman, J. G.; Graff, J. R.; Myohanen, S.; Nelkin, B. D.; Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 9821.
79. Zhang, Y. ; Bailey, V.; Puleo, C. M.; Easwaran, H.; Griffiths, E.; Herman, J. G.; Baylin, S. B.; Wang, T.-H. Lab Chip 2009, 9, 1059.
80. Hegi, M. E.; Diserens, A.-C.; Gorlia, T.; Hamou, M.-F.; de Tribolet, N.;
Weller, M.; Kros, J. M.; Hainfellner, J. A.; Mason, W.; Mariani, L.; Bromberg, J. E. ; Hau, P.; Mirimanoff, R. O.; Cairncross, J. G.; Janzer, R. C.; Stupp, R. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 997.
81. Preusser, M.; Janzer, R. C.; Felsberg, J.; Reifenberger, G.; Hamou, M.-F.; Diserens, A.-C.; Stupp, R.; Gorlia, T.; Marosi, C.; Heinzl, H.; Hainfellner, J. A.; Hegi, M. Brain Pathol. 2008, 18, 520.
82. Nicholson, W. L.; Comer, J. A.; Summer, J. W.; Gingrich-Baker, C.; Coughlin, R. T.; Magnarelli, L. A.; Olson, J. G.; Childs, J. E. J. Clin. Microbiol. 1997, 35, 1510.
83. Silva, Ados. S.; Vasconcelos, G. A.; Kappel, L. A.; Pinto, M. A.; Paula, V. S. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2012, 107, 960.
84. Holgate, C. S.; Jackson, P.; Cowen, P. N.; Bird, C. C. J. Histochem. Cytochem. 1983, 31, 938.
85. Goldsmith, S. J. Semin. Nuci. Med. 1975, 5, 125.
86. Kabiraj, A.; Gupta, J.; Khaitan, T.; Bhattacharya, P. T. Int. J. Biol. Med. Res. 2015, 6, 5204.
87. Iwadate, Y.; Matsutani, T.; Hasegawa, Y.; Shinozaki, N.; Oide, T.; Tanizawa, T.; Nakatani, Y.; Saeki, N.; Fujimoto, S. Exp. Ther. Med. 2010, 1, 53.
88. Ishiguro, K.; Shyam, K.; Penketh, P. G.; Sartorelli, A. C. Anal. Biochem. 2008, 383, 44.
89. Li, X.; Qian, S.; Zheng, L.; Yang, B.; He, Q.; Hu, Y. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 3189.
90. Yu, W.-T.; Wu, T.-W.; Huang, C.-L.; Chen, I.-C.; Tan, K.-T. Chem. Sci. 2016, 7, 301.
91. Lai, W.-Y.; Tan, K.-T. J. Chin. Chem. Soc. 2016, 63, ASAP.
92. Keppler, A.; Gendreizig, S.; Gronemeyer, T.; Pick, H.; Vogel, H.; Johnsson, K. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 86.
93. Pegg, A. E.; Boosalis, M.; Samson, L.; Moschel, R. C.; Byers, T. L.; Swenn, K.; Dolan, M. E. Biochemistry 1993, 32, 11998.
94. Kanugula, S.; Goodtzova, K.; Pegg, A. E. Biochem. J. 1998, 329, 545.
95. Mollwitz, B.; Brunk, E.; Schmitt, S.; Pojer, F.; Bannwarth, M.; Schiltz, M.; Rothlisberger, U.; Johnsson, K. Biochemistry 2012, 51, 986.
96. Damoiseaux, R.; Keppler, A.; Johnsson, K. ChemBioChem 2001, 2, 285.
97. Kaina, B.; Fritz, G.; Mitra, S.; Coquerelle, T. Carcinogenesis 1991, 12, 1857.
98. Ishibashi, T.; Nakabeppu, Y.; Kawate, H.; Sakumi, K.; Hayakawa, H.; Sekiguchi, M. Mutat. Res. 1994, 315, 199.
99. Yuan, L.; Lin, W.; Zheng, K.; He, L.; Huang, W. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 622.
100. Kobayashi, H.; Ogawa, M.; Alford, R.; Choyke, P. L.; Urano, Y. Chem. Rev. 2010, 110, 2620.
101. 劉淘愷,開發環境敏感螢光增益探針應用於蛋白質辨認與活體細胞蛋白質標記, 國立清華大學碩士論文, 2014.
102. Meyer, Y.; Richard, J.-A.; Delest, B.; Noack, P.; Renard, P.-Y.; Romieu, A. Org.
Biomol. Chem. 2010, 8, 1777.
103. 游椀婷,開發以分子轉子為基底的螢光增益探針應用於MGMT偵測與活體細胞影像,國立清華大學碩士論文, 2015.