本研究利用高生物相容性 (biocompatibility) 之幾丁聚醣 (chitosan) 還原具有表面電漿共振效應 (surface plasmon resonance effect) 的奈米銀做為肉眼辨識的生物感測器。且在此研究中利用不同濃度的人類血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 與chitosan進行接合來驗證此生物感測器檢測蛋白質的可行性，並使用穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy, TEM) 與紫外/可見光吸收光譜儀 (UV-Vis) 來探討其檢測機制。此外，本實驗亦將UV-Vis之光吸收圖譜轉化為色座標 (chromatic diagram) 來定量HSA的濃度。
本研究中首先探討chitosan還原奈米銀的反應機制，接著探討接合HSA之chitosan對還原奈米銀反應的影響。隨chitosan接合不同濃度的HSA，其所還原出奈米銀之粒徑分布及數量亦不相同，而造成奈米銀在顏色上會根據HSA的接合濃度而有明顯差異。且本研究也透過TEM和UV-Vis分析，進一步了解HSA影響chitosan還原奈米銀的機制。
本研究利用chitosan還原奈米銀的反應應用於比色法生物感測器 (colorimetric biosensor)。其機制為當HSA接合於chitosan上時會阻斷chitosan上能還原奈米銀的位置，且接合越多HSA，奈米銀就無法被還原。另外，亦可以透過改變chitosan濃度來調控HSA檢測區間。
本研究中，以HSA為待測物並利用chitsan接合HSA之後會生成不同顏色之奈米銀之特性，期望可以發展出肉眼辨識、方便使用、快速檢測且低成本讓每個人都能擁有之生物感測器，得以隨時了解自己身體的健康狀況。

In this study, silver nanoparticles (Ag NPs), which were synthesized by biocompatible chitosan, showed strong surface plasmon resonance (SPR) effect and were used to develop a naked-eye biosensor. Human serum albumin (HSA) with different concentrations were conjugated with chitosan to demonstrate the feasibility of protein sensing. The mechanism of Ag NP synthesis by HSA-conjugated chitosan was studied via UV-Vis spectra and TEM analyses. Furthermore, the UV-Vis spectra were transformed to chromatic diagram to characterize the color of synthesized Ag NPs to correlate the HSA concentration.
In this work, the mechanism of Ag NP synthesis by chitosan was discussed in the first instance, followed by the study on the effects of HSA-conjugated chitosan. The result showed that HSA with different concentrations restrained the reaction of Ag NP formation to different extent and therefore led to the color changes. Furthermore, UV-Vis and transmission electron microscopy (TEM) were used to analyze the Ag NPs to demonstrate the restraining effect caused by HSA.
Moreover, the effect of HSA on restraining the chemical reduction to form Ag NPs was applied to develop colorimetric biosensor. Through synthesis of Ag NPs in chitosan, which was conjugated with HSA of different concentrations, the lighter colors of Ag NPs were observed when the conjugating concentration of HSA is higher. The severe color change occurred when the formation of Ag NPs was completely retarded. Furthermore, the detecting range is adjustable through tuning the concentration of chitosan.
In summary, this study addresses a new mechanism that the synthesis of Ag NPs by chitosan would be restrained by conjugating proteins on chitosan to provide a naked-eye, convenient, instant-detecting and cost-effective biosensor for everyone.

目錄
摘要 I
Abstract II
誌謝 IV
目錄 VII
圖目錄 X
表目錄………………………………………………………………...XVI
第一章 緒論 1
第二章 文獻回顧 3
2.1 奈米銀之應用 3
2.2 使用幾丁聚醣 (chitosan) 合成奈米銀 5
2.2.1 幾丁聚醣 (chitosan) 之結構與特性 5
2.2.2 幾丁聚醣 (chitosan) 合成奈米銀機制 6
2.3 比色法生物感測器 (colorimetric biosensor) 7
2.3.1 奈米金生物感測器 7
2.3.2 酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA) 8
2.3.3 奈米銀生物感測器 10
2.3.4 表面電漿共振之光學式生物感測器 11
2.4 人類血清白蛋白 (human serum albumin) 檢測 12
第三章 實驗流程與方法 13
3.1 幾丁聚醣溶液製備流程 15
3.2 幾丁聚醣接合蛋白質分子之製備流程 18
3.2.1 幾丁聚醣接合蛋白質分子之驗證流程 18
3.2.2 幾丁聚醣接合人類血清白蛋白 (HSA) 之製備流程 20
3.2.3 幾丁聚醣接合小牛血清蛋白 (BSA) 之製備流程 21
3.3 奈米銀合成流程 23
3.3.1 幾丁聚醣合成奈米銀流程 23
3.3.2 蛋白質分子合成奈米銀流程 25
3.3.3 蛋白質分子-幾丁聚醣合成奈米銀流程 27
3.4 生物感測器之檢測方式 31
3.4.1 幾丁聚醣 (chitosan) 合成奈米銀機制 31
3.4.2 運用色卡作為人類血清白蛋白 (HSA) 之定量機制 31
3.4.3 生物感測器之檢測流程 34
3.5 儀器簡介 35
3.5.1 場發射掃描式電子顯微鏡 (Field Emission Scanning Electron Microscopy) 35
3.5.2 高解析穿透式電子顯微鏡 (HR Transmission Electron Microscopy) 37
3.5.3 螢光顯微鏡 (Fluorescence Microscopy) 39
3.5.4紫外/可見光吸收光譜儀 (UV-Vis Spectroscopy) 41
3.5.5分光光度計 (Spectrophotometer) 43
第四章 實驗結果與討論 45
4.1 幾丁聚醣溶液製備最佳化與特性分析 46
4.1.1幾丁聚醣 (chitosan) 分散特性最佳化 46
4.1.2幾丁聚醣 (chitosan) 表面形貌與吸光特性分析 48
4.1.3幾丁聚醣 (chitosan) 接合蛋白質分子特性分析 50
4.2幾丁聚醣合成奈米銀反應之探討 51
4.2.1幾丁聚醣 (chitosan) 溶於不同溶劑對奈米銀合成反應影響 51
4.2.2幾丁聚醣 (chitosan) 濃度對奈米銀合成反應影響 53
4.2.3硝酸銀 (silver nitrate) 濃度對奈米銀合成反應影響 54
4.2.4反應酸鹼度對奈米銀合成反應影響 55
4.2.5反應溫度對奈米銀合成反應影響 57
4.2.6幾丁聚醣合成奈米銀最佳化實驗結果 61
4.3 人類血清白蛋白接合幾丁聚醣 (HSA-conjugated chitosan) 合成奈米銀反應探討 65
4.3.1人類血清白蛋白 (HSA) 合成奈米銀反應之探討 65
4.3.2幾丁聚醣濃度對幾丁聚醣接合人類血清白蛋白合成奈米銀反應影響 68
4.3.3人類血清白蛋白接合濃度對合成奈米銀反應影響 73
4.4 小牛血清蛋白接合幾丁聚醣 (BSA-conjugated chitosan) 合成奈米銀反應探討 82
4.4.1小牛血清蛋白接合濃度對合成奈米銀反應影響 82
4.4.2 小牛血清蛋白接合幾丁聚醣的殺菌應用 85
4.5　人類血清白蛋白 (HSA) 濃度定量分析 87
4.5.1光學特性分析與探討 87
4.5.2色座標轉換與色差計算 90
第五章 結論 95
第六章 未來展望 97
第七章 參考文獻 99
本研究產出之論文發表 104 

圖目錄
圖 2.1 (a) 不同粒徑奈米銀之紫外-吸收光光譜圖 (b) 不同粒徑奈米銀之顏色比較。 3
圖 2.2 幾丁聚醣還原奈米銀之反應機構。 7
圖 3.1本研究之實驗流程圖。 14
圖 3.2幾丁聚醣結構式。 16
圖 3.3 (a) 將chitosan粉末溶於1%的醋酸水溶液中並用攪拌子攪拌6 hr 以上使之完全溶解，(b) 在完全溶解之chitosan溶液中加入1 M 之氫氧化鈉直至chitosan完全析出，(c) 使用離心機將鹼性之chitosan液離心3次，並將洗出之幾丁聚醣顆粒分散於去離子水中。………………………………………………… 17
圖 3.4 (a) chitosan分散於去離子水溶液之中，(b) 加入溶於PBS (phosphate buffered saline, pH = 7.4) 中濃度為1 mg/ml之螢光蛋白質AHSA-FITC溶液取1 μl 加入1 ml 之chitosan水溶液中並維持在30C之超音波震盪器中震盪 2 小時，(c) 使用離心機將溶液離心3次，並將洗出之AHSA-FITC-conjugated chitosan分散於PBS中。 19
圖 3.5 (a) chitosan溶液以6000 rpm 轉速下離心15分鐘，並去除離心後混合溶液之液體部分，留下沉澱物chitosan，(b) 將HSA水溶液加入chitosan中並在超音波震盪器中將水溫維持在30 C持續震盪2小時。…………………………………………20
圖 3.6 (a) chitosan溶液以6000 rpm 轉速下離心15分鐘，並去除離心後混合溶液之液體部分，留下沉澱物chitosan，(b) 將BSA水溶液加入chitosan中並在超音波震盪器中將水溫維持在30 C持續震盪2小時。……………………………………………22
圖 3.7 (a) 將分散均勻之chitosan溶液至於玻璃試管中，(b) 將含有chitosan溶液的玻璃試管放置水浴中加熱至90C，並以攪拌子攪拌以使反應均勻，接著緩慢滴入46 mM之硝酸銀水溶液並維持加熱10分鐘。…………………………………………24
圖 3.8 (a) 將HSA溶於無菌之去離子水中，(b) 將含有HSA水溶液的玻璃試管放置水浴中加熱至90C，並以攪拌子攪拌以使反應溫度均勻，接著緩慢滴入46 mM之硝酸銀水溶液並維持加熱10分鐘。…………………………………………………26
圖 3.9 (a) 將分散均勻之HSA-conjugated chitosan溶液至於玻璃試管中，(b) 將含有HSA-conjugated chitosan溶液的玻璃試管放置水浴中加熱至90C，並以攪拌子攪拌以使反應均勻，接著緩慢滴入46 mM之硝酸銀水溶液並維持加熱10分鐘。………28
圖 3.10 (a) 將分散均勻之BSA-conjugated chitosan溶液至於玻璃試管中，(b) 將含有BSA-conjugated chitosan溶液的玻璃試管放置水浴中加熱至90C，並以攪拌子攪拌以使反應均勻，接著緩慢滴入46 mM之硝酸銀水溶液並維持加熱10分鐘。……….30
圖 3.11幾丁聚醣還原奈米銀機制示意圖，(a) 銀離子吸引示意圖，(b) 氧化銀合成反應示意圖，(c) 奈米銀形成反應示意圖。………………………………………………………….….31
圖 3.12生物感測器使用流程，(a) 將未知濃度的HSA檢體加入chitosan中並在超音波震盪器中將水溫維持在30C持續震盪2小時，(b) 將分散均勻之HSA-conjugated chitosan溶液置於玻璃試管中，(c) 將含有HSA-conjugated chitosan溶液的玻璃試管放置水浴中加熱至90C，並以攪拌子攪拌以使反應均勻，接著緩慢滴入46 mM之硝酸銀水溶液並維持加熱10分鐘，(d) 將奈米銀顏色與色卡進行比對，即可找出待測檢體HSA的濃度。………………………………………………………………33
圖 3.13生物感測器應用流程。………………………………………34
圖 3.14 國立清華大學材料系之場發射掃描式電子顯微鏡 (FESEM
JSE-6500F)。…………………………………………………36
圖3.15國立清華大學材料實驗館內之穿透式電子顯微鏡 (JEOL JEM-2010)。…………………………………………………….38
圖3.16 國立清華大學分子醫學所張晃猷教授實驗室提供之螢光光學
顯微鏡 (OLYMPUS BX51)。…………………………………40
圖3.17 國立清華大學化學系陳建添教授實驗室提供之紫外/可見光吸收光譜儀(Metertech. SP-8001)。………………………………42
圖3.18 國立交通大學生科系彭慧玲教授實驗室提供之分光光度計 (Thermo Scientific, genesis 20)。…………………………….44
圖 4.1 (a) chitosan之SEM影像，(b) chitosan之OM影像。 48
圖 4.2 (a) chitosan之UV-Vis量測，(b) chitosan分散於去離子水照片。 49
圖 4.3 AHSA-FITC-conjugated chitosan之FM 分析。 50
圖4.4 chitosan分散於不同溶劑合成奈米銀之流程與結果比較 (a) chitosan分散於PBS中之反應流程，(b) chitosan分散於去離子水中之反應流程，(c) chitosan分散於PBS中最後反應結果照片，(d) chitosan分散於去離子水中最後反應結果照片。…………………………………………………………….52
圖 4.5不同反應酸鹼度下chitosan還原奈米銀之UV-Vis量測，(a) pH 3之溶液，(b) pH3之反應結果照片，(c) pH 7 之溶液，(d) pH 7之反應結果照片，(e) pH 13 之溶液，(f) pH 13之反應結果照片，(g) chitosan上胺基吸引銀離子反應機制。………...56
圖 4.6不同溫度下chitosan還原奈米銀之UV-Vis量測，(a) 反應溫度60C之溶液，(b) 反應溫度60C之反應結果照片，(c) 反應溫度80C 之溶液，(d) 反應溫度80C之反應結果照片，(e) 反應溫度90C之溶液，(f) 反應溫度90C之反應結果照片。
....………………………………………………………………..58
圖 4.7 相同反應溫度下，不同方法加入硝酸銀方式對奈米銀合成解果以UV-Vis光譜作比較，(a) 以一次加入1 ml，46 mM的方式，(b) 以每五秒鐘加入800 μl的速度加完1 ml，46 mM的方式。……………………………………………………...60
圖 4.8 (a) chitosan合成之奈米銀SEM影像 (b) 合成之奈米銀X光能量散布分析 (EDX)。…………………………………………62
圖 4.9 (a) 小顆粒狀奈米銀之穿透式電子顯微鏡 (TEM) 明場影像，(b) 小顆粒狀奈米銀之粒徑分布，(c) 大顆粒狀銀之TEM明場影像，(d) 小顆粒狀奈米銀放大倍率之TEM明場影像，(e) 小顆粒狀奈米銀之繞射圖形 (diffraction patteren)，(f) 小顆粒狀奈米銀之繞射點與相對應結晶面之對照表。………………………..63
圖 4.10 chitosan與chitosan合成奈米銀之UV-Vis量測比較。(a) chitosan之吸收圖譜，(b) chitosan合成奈米銀之吸收圖譜。.64
圖 4.11 1 mg/ml HSA溶於不同溶劑中加入硝酸銀之反應
(a) HSA 溶於去離子水中，(b) HSA 溶於PBS中。………66
圖 4.12不同chitosan濃度接合0.1 mg/ml之HSA對奈米銀反應之TEM觀測，(a) 0.12% chitosan還原之小顆粒奈米銀，(b) 0.12% chitosan還原之大顆粒銀，(c) 0.3% chitosan還原之小顆粒奈米銀，(d) 0.3% chitosan還原之大顆粒銀，(e) 0.75% chitosan還原之小顆粒奈米銀，(f) 0.75% chitosan還原之大顆粒銀，(g) 不同chitosan濃度接合0.1 mg/ml HSA還原奈米銀之想像機制。………………………………………………..70
圖 4.13不同chitosan濃度接合0.1 mg/ml之HSA對奈米銀反應之UV-Vis光譜分析。……..………………………….…….…..72
圖 4.14不同HSA濃度接合0.3% chitosan對奈米銀反應之TEM觀測，(a) 未接合HSA還原之奈米銀顆粒，(b) 未接合HSA還原之大顆粒銀，(c) 接合0.1 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒，(d) 接合0.1 mg/ml HSA還原之大顆粒銀，(e) 接合0.3 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒，(f) 接合0.3 mg/ml HSA還原之大顆粒銀，(g) 接合1 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒，(h) 接合1 mg/ml HSA還原之大顆粒銀。……………………….75
圖 4.15 經由TEM分析不同HSA濃度接合0.3% chitosan所還原之奈米銀，經過隨機計算100顆所得之粒徑分布，(a) 未接合HSA還原之奈米銀顆粒，(b) 接合0.1 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒，(c) 接合0.3 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒，(d) 接合1 mg/ml HSA還原之奈米銀顆粒。………………………...77
圖 4.16 chitosan 接合不同濃度之HSA還原奈米銀之想像機制。…………………………………………………………..79
圖 4.17 不同HSA濃度接合0.3% chitosan對奈米銀反應之UV-Vis 分析，(a) 吸收度 (absorbance) 對波長作圖，(b) 吸收百分比 (absorption) 對波長作圖。……………………………………81
圖 4.18 chitosan接合BSA還原之奈米銀粒徑分布對BSA濃度作圖。……………………………………………………………83
圖 4.19 chitosan接合BSA還原之奈米銀 (a) UV-Vis，(b) 不同BSA濃度與其表面電漿共振吸收峰之波長比較。………………..85
圖 4.20 由BSA接合chitosan還原之奈米銀對綠膿桿菌 (p.a) 之殺菌效果探討，(a) 綠膿桿菌 (p.a.) 吸光值對加入不同BSA濃度合成之奈米銀後培養時間之關係圖，(b) 綠膿桿菌 (p.a.) 吸光值對加入不同小牛血清蛋白濃度合成之奈米銀後6小時之吸光值比較。………………………………………………….86
圖 4.21 0.3% chitosan在 (a) 不同HSA接合濃度合成之奈米銀吸收光譜，(b) 檢測溶液幾丁聚醣之反應製備條件，(c) HSA接合濃度與還原奈米銀之顏色對應色卡。………………..…88
圖 4.22 0.12% chitosan在 (a) 不同HSA接合濃度合成之奈米銀吸收光譜，(b) 檢測溶液chitosan之反應製備條件，(c) HSA接合濃度與還原奈米銀之顏色對應色卡。…………..……89
圖 4.23 不同chitosan濃度對不同 HSA 接合濃度合成之奈米銀之色座標轉換及色差計算流程，(b) 0.3% chitosan接合人類血清白蛋白還原之奈米銀於色座標位置，(c) 0.3% chitosan色差對HSA濃度關係圖，(e) 0.12% chitosan接合HSA還原之奈米銀於色座標位置，(c) 0.12% chitosan色差對HSA濃度關係圖。……………………………………………………….…..91
圖 4.24 (a) 兩不同chitosan濃度還原出奈米銀色差對HSA濃度之關係曲線，(b) 將4.24(a) 經過Normalize 之後之關係曲線。.93

圖 4.25 (a) 三不同chitosan濃度還原出奈米銀色差對HSA濃度之關係曲線並經過Normalize分析，(b) 三不同chitosan濃度還原出奈米銀顏色對HSA濃度之色卡。……………………….94

表目錄
表 4.1 不同析出程度之chitosan對分散特性之影響，橘色的小方框圈出的是chitosan最高的液面而大方框則是圈出最佳參數。..47
表 4.2 不同chitosan濃度下，奈米銀還原反應之比較。……….….53
表 4.3不同硝酸銀濃度下，奈米銀還原反應之比較。…….………..54
表 4.4 (a) 奈米銀反應條件，(b) 調變HSA濃度對合成奈米銀反應之影響。……………………………………………………………67
表 4.5不同chitosan濃度接合0.1 mg/ml之HSA對奈米銀反應之影響。 . 68
表 4.6不同HSA濃度接合0.3% chitosan對奈米銀顏色比較。…73
表 4.7不同BSA濃度接合chitosan對還原奈米銀顏色及TEM比較。……………………………………………………………..83

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