細菌視紫質( bacteriorhodopsin，HsbR )是鑲嵌於嗜鹽古細菌H. salinarum細胞膜上的膜蛋白，經可見光激發後，得在細胞膜內外兩側產生質子濃度梯度，用以提供合成生物能量ATP所需之化學勢位，因此可將細菌視紫質視為具有光驅動質子幫浦功能的膜蛋白。而經可見光激發後所進行的光迴圈反應之動力學行為，可以中間態K、L、M、N以及O描述之。而近期的研究指出，另一嗜鹽古細菌H. marismortui細胞膜上同時存在兩個有相同吸收光區且具有光驅動質子幫浦功能的細菌視蛋白－HmbRI與HmbRII。在單一生物系統中，為何存在兩個具有相同離子幫浦功能的膜蛋白，引起學者的重視。本論文中，吾人將利用時間解析瞬態吸收差異光譜以及整體指數擬合，探討細菌視紫質HmbRI、HmbRII以及HsbR，在pH值4-8範圍內，經波長532 nm可見光激發後的光化學反應之動力學行為。
由HmbRI的時間解析瞬態吸收差異光譜，可觀察到相同於以往光迴圈反應的中間態，包括M、N以及O中間態，但由M中間態回到HmbRI基態的過程中，出現一個分支反應，才能夠完整地擬合實驗得到的數據。而此對應的中間態M′指認為以全反式( all-trans )視黃醛構形存在的去質子化席夫鹼，出現於M中間態消逝後。此過程表示部分HmbRI得先進行視黃醛再異構化反應後，才進行去質子化之席夫鹼的再質子化。而HmbRI的光迴圈反應中出現分支反應，可能是由於其α螺旋D與E之間以較長的迴圈連接，將有利於HmbRI在進行再異構化時的結構扭曲。而HmbRII的光迴圈反應，只經過M以及N中間態，並未發現O中間態之瞬態佈居分布。其原因可能是HmbRII靠近胞內側的電荷分布相較於HsbR以及HmbRI有較多去質子化的羧基側鏈，導致其光迴圈反應中於N態至O態之動力學行為有所不同。而由HmbRI與HmbRII進行的光迴圈反應之動力學行為與外界環境pH值相依性的結果，亦證明吾人提出的動力學模型適合套用於HmbRI以及HmbRII的光迴圈系統。

第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 文獻回顧與實驗動機 1
1.2.1 嗜鹽古細菌、紫膜及細菌視紫質的發現與研究 1
1.2.2 實驗動機與目的 2

第二章 細菌視紫質與紫膜的性質 5
2.1 細菌視紫質的結構 5
2.2 紫膜的組成與結構 6
2.3 紫膜與細菌視紫質的穩態紫外/可見光吸收光譜特性 6
2.4 細菌視紫質的光迴圈反應與瞬態可見光吸收光譜特性 7
2.5 細菌視紫質的光迴圈反應其動力學行為與其結構狀態之比較 9
2.6 細菌視紫質的光迴圈動力學行為與外界環境pH值相依性 10
2.6.1 紫膜的光迴圈動力學與pH值相依性 10
2.6.2 單體細菌視紫質的光迴圈動力學與pH值相依性 11
2.7 嗜鹽古細菌Haloarcular marismortui的發現與性質 12

第三章 光譜技術原理、儀器架設、實驗方法與數據處理 23
3.1 光譜技術原理 23
3.1.1 穩態紫外/可見光吸收光譜法 23
3.1.2 瞬態吸收光譜 25
3.2 儀器架設 25
3.2.1 穩態紫外/可見光吸收光譜儀 25
3.2.2 單波長可見光瞬態吸收光譜法 26
3.2.3 校正雷射能量隨時間之衰減 27
3.3 實驗方法 28
3.3.1 嗜鹽古細菌培養方法 28
3.3.2由嗜鹽古細菌萃取紫膜流程 29
3.3.3 HsbR單體細菌視紫質的製備方法 30
3.3.4 HmbRI以及HmbRII的製備方法 30
3.3.5 實驗樣品的製備 31
3.3.6 實驗藥品 31
3.4 儀器參數設定 32
3.4.1 穩態紫外/可見光吸收光譜儀 32
3.4.2 單波長可見光瞬態吸收光譜儀 32
3.5 數據處理及分析 33

第四章 實驗結果與討論 43
4.1 序列分析 43
4.1.1 視黃醛周圍與質子化席夫鹼 43
4.1.2 質子釋放團與質子傳遞通道 44
4.1.3 胞內側獲取質子通道 44
4.1.4 帶電荷的胺基酸殘基分布 45
4.1.5 胞外側之迴圈與β摺板 45
4.2 穩態紫外/可見光吸收光譜 46
4.3 HsbR、HmbRI以及HmbRII的時間解析之瞬態吸收差異光譜 47
4.3.1 HsbR 48
4.3.2 HmbRI 49
4.3.3 HmbRII 53

第五章 結論 75

參考文獻 77

圖目錄
第二章
圖2-1 細菌視紫質的三級結構以及其進行光迴圈反應之質子傳遞步驟示意圖 14
圖2-2 細菌視紫質進行光迴圈反應其主要胺基酸與水分子所形成的氫鍵網絡示意圖 15
圖2-3 細菌視紫質以三聚體形式並以二維晶格結構排列形成紫膜之示意圖 16
圖2-4 純紫膜水溶液的紫外/可見光吸收光譜 17
圖2-5 細菌視紫質光迴圈反應中各個中間態的紫外/可見光吸收光譜圖 18
圖2-6 由Balashov等人所提出在不同pH值環境下之細菌視紫質進行的光迴圈反應之動力學及質子幫浦之模型 19
圖2-7 HsbR、HmbRI以及HmbRII的胺基酸序列比對 20

第三章
圖3-1 符合選擇律的電子躍遷之示意圖 35
圖3-2 閃光光解技術示意圖 36
圖3-3 瞬態吸收差異光譜 37
圖3-4 穩態紫外/可見光吸收光譜儀與內部構造圖 38
圖3-5 瞬態吸收光譜技術儀器架設圖 39
圖3-6 利用延遲脈衝時間產生器控制激發樣品之雷射重複頻率之示意圖 40
圖3-7 單波長可見光瞬態吸收光譜儀中偵測光與雷射激發光交互重疊示意圖 41
圖3-8 進行單波長瞬態吸收實驗前後量測到的相對雷射能量強度之平均 42
第四章
圖4-1 HsbR、HmbRI以及HmbRII的序列比對 56
圖4-2 環繞於HsbR之視黃醛周圍的胺基酸 57
圖4-3 HsbR中涉及傳遞質子的胺基酸空間分布 58
圖4-4 HsbR、HmbRI以及HmbRII的胞內側涉及獲取質子之胺基酸以及帶電荷的胺基酸殘基之空間分布 59
圖4-5 HsbR、HmbRI以及HmbRII在不同pH值環境下歸一化紫外/可見光吸收光譜 60
圖4-6 選擇激發細菌視紫質的雷射重複頻率 61
圖4-7 HsbR、HmbRI以及HmbRII在不同pH值環境下之時間解析瞬態吸收差異光譜等值圖 62
圖4-8 比較HsbR、HmbRI以及HmbRII在pH 5.8環境下由實驗得到的時間解析瞬態差異吸收光譜等值圖與式4-1至式4-4的動力學模型之整體指數擬合的結果 63
圖4-9 比較由實驗以及擬合得到於不同pH值下的HsbR、HmbRI以及HmbRII在特定偵測波長之差異吸收的時間側寫 64
圖4-10 由整體指數擬合得到HsbR、HmbRI以及HmbRII在pH 5.8下之各個中間態相較於其基態的差異吸收光譜圖 65
圖4-11 比較HsbR、HmbRI以及HmbRII在不同pH值下由實驗得到的數據與整體指數擬合的結果模擬各個偵測波長之差異吸收的時間側寫 66
圖4-12 HsbR、HmbRI以及HmbRII在不同pH值環境下的各個中間態之佈居分布的時間側寫 67
圖4-13 由整體指數擬合得到HsbR、HmbRI以及HmbRII在不同pH值環境下的各個中間態較於其基態的差異吸收光譜圖 68
圖4-14 HmbRI以及HmbRII在pH 5.8環境下之偵測波長於410 nm的差異吸收時間側寫 69
圖4-15 HmbRI與HmbRII經可見光激發後所進行的光迴圈反應之動力學模型示意圖 70

第五章
圖5-1 HsbR、HmbRI以及HmbRII的光迴圈反應之示意圖 76

表目錄
表2-1 胺基酸中英文全名與簡寫對照表 21
表4-1 比較HsbR、HmbRI以及HmbRII參與傳遞質子的胺基酸序列比對 71
表4-2 激發於不同pH值下之細菌視紫質的雷射重複頻率 73
表4-3 HsbR與HmbRI兩者之光迴圈反應中的中間態吸收特徵 74

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