酵素催化訊號放大為分析低濃度蛋白質及生物標誌物時常見的偵測手法，其優點有酵素對受質具有專一性，且可即時性的催化受質產生放大之光學或電子訊號。典型的酵素催化訊號放大偵測例子為酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)，雖然ELISA已被成功應用於許多分析物之偵測，但繁複的清洗步驟以及必須將酵素標定於抗體，使其局限於實驗室中進行。因此許多研究致力於發展新的免標定、免清洗之利用酵素催化訊號放大的偵測方法。
我們提出新的利用雙功能分子探針，經由立體障礙調節酵素催化活性之免標定、免清洗的蛋白質偵測方法。我們的偵測設計主要是基於立體障礙會影響蛋白質和配體之間的結合，設計出含有目標蛋白結合配體以及酵素抑制劑之雙功能探針，在此偵測設計中目標蛋白結合配體和酵素抑制劑之間的長度為影響目標蛋白和酵素之間立體障礙的重要因素，長度較短的探針會使立體障礙增加達到較強之放大訊號。雙功能探針之抑制端可抑制住酵素催化活性，當目標蛋白和探針辨識端結合後，兩者之間的立體障礙使探針抑制力減弱，酵素恢復活性藉由催化螢光基質達到訊號放大之目的。

摘要 i
Abstract ii
謝誌 iii
目錄 iv
第一章 緒論 1
§1-1 酶與非酶蛋白質 (Enzyme and Non-Enzymatic Protein) 1
§1-2 訊號放大之偵測方法 (Signal Amplification Detection) 3
1-2.1 酵素結合免疫吸附分析法 (ELISA) 3
1-2.2 調節酵素催化活性之訊號放大偵測 5
§1-3 研究動機與目標 8
第二章 文獻回顧 9
§2-1 以適配體為基礎之訊號放大偵測蛋白質 (Aptamer-Based Signal Amplification Detection of Protien)[19] 9
2-1.1 適配體結合脫氧核酶之蛋白質偵測 (Aptamer–DNAzyme Conjugates for Protein Detection) 9
2-1.2 適配體酶次單元之蛋白質偵測 (Aptameric Enzyme Subunit for Protein Sensing) 12
2-1.3切口酶協助訊號放大之適配體偵測蛋白質方法 (Nicking Ezyme Assisted Signal Amplification for Protein Sensing) 13
§2-2 金奈米粒子偵測蛋白質 (Gold Nanoparticles for Protein Detection) 14
2-2.1 酶-金奈米粒子之訊號放大偵測蛋白質 (Enzyme-Nanoparticle Sensor for Amplified Protein Detection) 15
第三章 生物感測器設計構想 17
§3-1 生物感測器設計構想 17
第四章 實驗結果與討論 21
§4-1 hCAⅡ蛋白製備 21
§4-2抗生物素蛋白之偵測 21
4-2.1 抗生物素蛋白雙功能探針之合成 22
4-2.2 抗生物素蛋白之螢光訊號放大偵測 22
§4-3 醣蛋白之偵測 30
4-3.1 醣蛋白雙功能探針之合成 30
4-3.2 醣蛋白之螢光訊號放大偵測 31
§4-4 DNA烷基轉移酶之偵測 41
4-4.1 DNA烷基轉移酶之螢光訊號放大偵測 42
§4-5 於尿液中進行蛋白質螢光訊號放大偵測 54
第五章 結論 58
第六章 實驗部分 59
§6-1 實驗器材及藥品 59
§6-2 化合物合成實驗與光譜資料 63
§6-3 蛋白質表現與純化 84
6-3.1 配製儲備液(Stock solution)及緩衝溶液(Buffer) 84
6-3.2 蛋白質表現(Protein expression) 87
6-3.3 蛋白質純化(Protein purification) 88
6-3.4 SDS-膠體電泳 (SDS-Page) 91
參考文獻 93
附錄 97

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(37) 施柏銘，國立清華大學碩士論文，2012。