細菌視紫質是一種光合成蛋白，鑲嵌於嗜鹽古細菌H. salinarium的細胞膜，受到可見光的激發後在細胞膜內外兩側產生質子濃度梯度，作為合成ATP的化學勢位。細菌視紫質的光迴圈反應過程會產生一系列可利用可見光吸收的特徵峰區別出的中間態，如K、L、M、N和O，其中M態的生成被認為是質子化席夫鹼去質子化並將質子傳遞給反離子Asp-85的過程。在過去已有不少文獻研究細菌視紫質光迴圈反應的量子產率，但鮮少研究其與激發波長的相依性。本篇論文中將利用可調變波長雷射光以及瞬態可見光吸收光譜技術搭配即時的能量偵測，探討在不同pH值下，細菌視紫質光迴圈反應M態量子產率與激發波長的相依性。
激發波長在500 nm至600 nm間，M態量子產率不隨著激發波長的改變產生明顯變化，相對地，在600 nm以上，量子產率隨著激發波長的增加而減少，這可能是在視黃醛激發態的位能曲面上存在著一個約1 kcal mol-1的位能障礙在弗蘭克-康登範圍與朗道-齊納跨越範圍之間所導致，隨著激發能量下降，跨越位能障礙的速率降低使視黃醛異構化的量子產率下降，進而使後續的M態量子產率減少。而在激發波長小於500 nm的範圍，M態量子產率則隨著激發波長的縮小而減少，這可能是由於視黃醛吸收較高能量光子後產生振動熱激發態而與不參與異構化的振動模式偶合，因而使視黃醛異構化的量子產率下降，進而使後續M態量子產率減少。另外，隨著pH值的降低，細菌視紫質的可見光吸收光譜產生紅位移，這被認為是藍膜的生成。吾人發現相對於紫膜，藍膜具有較低的M態生成效率，這可能是由於Asp-85質子化使視黃醛的激發態位能曲面發生改變，進而使異構化後續的M態量子產率減少。

第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 文獻回顧與實驗動機 1
1.2.1 古嗜鹽細菌、紫膜及細菌視紫質的發現與研究 1
1.2.2 實驗動機與目的 3
第二章 紫膜和細菌視紫質的性質 5
2.1 細菌視紫質與紫膜的組成與結構 5
2.2 細菌視紫質的光迴圈特性 6
2.3 紫膜的光譜特性 8
2.3.2 紫外/可見光吸收光譜特性 8
2.3.3 瞬態可見光吸收光譜特性 8
2.4 紫膜光迴圈動力學行為與激發光強度的相依性 9
2.5 紫膜光迴圈動力學行為與環境pH值的相依性 10
2.6 細菌視紫質光迴圈反應量子產率 12
2.6.1 量子產率 12
2.6.2 激發波長相依性 12
第三章 光譜技術原理、儀器架設與原理、實驗方法、儀器參數設定及數據處理 20
3.1 光譜技術原理 20
3.1.1 紫外/可見光吸收光譜 20
3.1.2 瞬態吸收光譜 22
3.2 儀器架設與原理 23
3.2.1 靜態紫外/可見光吸收光譜 23
3.2.2 單波長可見光瞬態吸收光譜技術儀器架設 23
3.2.3 雷射能量控制 25
3.3 實驗方法 27
3.3.1 H. salinarium S9菌株培養 27
3.3.2 紫膜的萃取 28
3.3.3 實驗樣品的製備 29
3.3.4 實驗藥品 29
3.4 儀器參數設定 30
3.4.1 靜態紫外/可見光吸收光譜儀 30
3.4.2 單波長可見光瞬態吸收光譜儀 30
3.5 數據處理 30
3.5.1 簡介 30
3.5.2 可見光瞬態吸收光譜訊號 31
3.5.3 雷射能量 32
3.5.4 量子產率計算 32
3.5.5 誤差計算 33
第四章 結果與討論 41
4.1 紫膜的紫外/可見光吸收光譜 41
4.2 M態瞬態吸收光譜與動力學模型分析 41
4.3 M態量子產率 46
4.3.1 無波長相依性區(500 nm-600 nm) 47
4.3.2 紅光區(600 nm-670 nm) 48
4.3.3 藍光區(500 nm-430 nm) 50
第五章 結論 61
5.1 紫膜光迴圈反應的M態生成量子產率與激發波長相依性 61
5.2 藍膜不具備光迴圈活性 61
5.3 未來展望 62
圖目錄
第二章
圖2-1細菌視紫質的蛋白質二級結構示意圖 14
圖2-2細菌視紫直光迴圈反應中心與胞外側的氫鍵網結構示意圖 15
圖2-3細菌視紫質的三聚體二維結晶排列俯視示意圖 16
圖2-4紫膜水溶液的紫外/可見光吸收光譜 17
圖2-5細菌視紫質光迴圈反應中各個中間態的紫外/可見光吸收光譜圖 17
圖2-6由Lanyi等人所提出在不同pH環境下細菌視紫質的光迴圈反應模型 18
第三章
圖3-1分子價電子的躍遷形式示意圖 35圖3-2閃光光解技術示意圖 35
圖3-3靜態紫外/可見光吸收光譜儀架設示意圖 36
圖3-4 USB4000紫外/可見光光譜儀構造 36
圖3-5瞬態吸收光譜示意圖 37
圖3-6實驗儀器架設圖 38
圖3-7不均勻雷射光斑與經由光圈調整過後均勻雷射光班示意圖。 39
圖3-8單波長可見光瞬態吸收光譜儀中偵測光與激發光交互重疊的示意圖 40
第四章
圖4-1紫膜溶液在不同pH環境下的靜態紫外/可見光吸收光譜 52
圖4-2利用pH=7以及pH=3環境下的紫膜溶液紫外/可見光吸收光譜所擬合的光譜與原始光譜的比較圖 52
圖4-3以570 nm雷射激發細菌視紫質光迴圈反應的M態最大瞬態布居分布與激發光強度相依性圖 53
圖4-4 M態最大瞬態布居分布與激發光強度相依性圖 53
圖4-5 M態瞬態吸收光譜與以式(3-16)最佳適解曲線的比較圖 54
圖4-6 k1與k2與pH以及激發波長之間的相依性 55
圖4-7可逆與不可逆反應模型所模擬出的M態瞬態布居分布比較圖 56
圖4-8 M態量子產率以及均一化結果 57
圖4-9細菌視紫質光迴圈反應中異構化反應座標軸上視黃醛基態S0與激發態
S1的位能曲面示意圖 58
圖4-10細菌視紫光迴圈異構化反應的微正則變量過渡態理論模型示意圖 59
圖4-11 pH=7與pH=4均一化的量子產率以及靜態紫外/可見光吸收光譜的疊圖 60
第五章
圖5-1藍膜與紫膜之光迴圈效率的比較示意圖 62
表目錄
第二章
表2-1胺基酸中英文全名與簡寫對照表 29
表4-1 Lórenz-Fonfría和Kandori所計算出的光迴圈反應速率常數整理 60

(1)Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin, chemistry of. In Wiley Encyclopedia of Chemical Biology; Begley, T. P., Ed.; John Wiley & Sons, Inc., 2009; Vol. 1, 178.
(2)Mitchell, P. Nature (London, U. K.) 1961, 191, 144.
(3)Stoeckenius, W.; Rowen, R. J. Cell Biol. 1967, 34, 365.
(4)Stoeckenius, W. Protein Sci. 1999, 8, 447.
(5)Oesterhelt, D.; Stoeckenius, W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1973, 70, 2853.
(6)Henderson, R.; Unwin, P. N. Nature 1975, 257, 28.
(7)Terner, J.; El-Sayed, M. A. Acc. Chem. Res. 1985, 18, 331.
(8)Rothschild, K. J.; Zagaeski, M.; Cantore, W. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981, 103, 483.
(9)Hackett, N. R.; Stern, L. J.; Chao, B. H.; Kronis, K. A.; Khorana, H. G. J. Biol. Chem. 1987, 262, 9277.
(10)Braiman, M. S.; Mogi, T.; Marti, T.; Stern, L. J.; Khorana, H. G.; Rothschild, K. J. Biochemistry 1988, 27, 8516.
(11)Gerwert, K.; Hess, B.; Soppa, J.; Oesterhelt, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989, 86, 4943.
(12)Váró, G. Acta Biol. Acad. Sci. Hung. 1981, 32, 301.
(13)Drachev, L. A.; Kaulen, A. D.; Skulachev, V. P. FEBS Lett. 1984, 178, 331.
(14)Khorana, H. G.; Gerber, G. E.; Herlihy, W. C.; Gray, C. P.; Anderegg, R. J.; Nihei, K.; Biemann, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979, 76, 5046.
(15)De, G. H. J. M.; Harbison, G. S.; Herzfeld, J.; Griffin, R. G. Biochemistry 1989, 28, 3346.
(16)Harbison, G. S.; Smith, S. O.; Pardoen, J. A.; Courtin, J. M. L.; Lugtenburg, J.; Herzfeld, J.; Mathies, R. A.; Griffin, R. G. Biochemistry 1985, 24, 6955.
(17)Khorana, H. G. J Biol Chem 1988, 263, 7439.
(18)Váró, G.; Keszthelyi, L.; Eisenstein, L. “The role of water in the proton pumping mechanism of bacteriorhodopsin”, 1987.
(19)Henderson, R.; Baldwin, J. M.; Ceska, T. A.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K. H. J. Mol. Biol. 1990, 213, 899.
(20)Landau, E. M.; Rosenbusch, J. P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 14532.
(21)Luecke, H.; Schobert, B.; Richter, H.-T.; Cartailler, J.-P.; Lanyi, J. K. J. Mol. Biol. 1999, 291, 899.
(22)Neutze, R.; Pebay-Peyroula, E.; Edman, K.; Royant, A.; Navarro, J.; Landau, E. M. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 2002, 1565, 144.
(23)Hampp, N.; Oesterhelt, D. Bacteriorhodopsin and Its Potential in Technical Applications. In Nanobiotechnology; Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005, 146.
(24)Chen, Z.; Birge, R. R. Trends Biotechnol. 1993, 11, 292.
(25)Walter, J. M.; Greenfield, D.; Liphardt, J. Curr. Opin. Biotechnol. 2010, 21, 265.
(26)Birge, R. R.; Gillespie, N. B.; Izaguirre, E. W.; Kusnetzow, A.; Lawrence, A. F.; Singh, D.; Song, Q. W.; Schmidt, E.; Stuart, J. A.; Seetharaman, S.; Wise, K. J. J. Phys. Chem. B 1999, 103, 10746.
(27)Hampp, N. Nanobiotechnology enables new opportunities in material sciences: Bacteriorhodopsin as a first example. In Bionanotechnology: Proteins to Nanodevices; Renugopalakrishnan, V., Lewis, R. V., Eds.; Springer: Dordrecht, 2006, 209.
(28)Becher, B.; Ebrey, T. G. Biophys. J. 1977, 17, 185－191.
(29)Goldschmidt, C. R.; Kalisky, O.; Rosenfeld, T.; Ottolenghi, M. Biophys. J. 1977, 17, 179－183.
(30)Goldschmidt, C. R.; Ottolenghi, M.; Korenstein, R. Biophys. J. 1976, 16, 839－843.
(31)Govindjee, R.; Balashov, S. P.; Ebrey, T. G. Biophys. J. 1990, 58, 597－608.
(32)Ort, D. R.; Parson, W. W. Biophys. J. 1979, 25, 341－353.
(33)Polland, H.-J.; Franz, M. A.; Zinth, W.; Kaiser, W.; Köelling, E.; Oesterhelt, D. Biophys. J. 1986, 49, 651－662.
(34)Birge, R. R.; Cooper, T. M.; Lawrence, A. F.; Masthay, M. B.; Vasilakis, C.; Zhang, C.-F.; Zidovetzki, R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 4063－4074.
(35)Logunov, S. L.; El-Sayed, M. A.; Song, L.; Lanyi, J. K. J. Phys. Chem. 1996, 100, 2391－2398.
(36)Logunov, S. L.; Song, L.; El-Sayed, M. A. J. Phys. Chem. 1994, 98, 10674－10677.
(37)Rohr, M.; Gäertner, W.; Schweitzer, G.; Holzwarth, A. R.; Braslavsky, S. E. J. Phys. Chem. 1992, 96, 6055－6061.
(38)Tittor, J.; Oesterhelt, D. FEBS Lett. 1990, 263, 269－273.
(39)Morgan, J. E.; Gennis, R. B.; Maeda, A. Photochem. Photobiol. 2008, 84, 1038.
(40)Wolf, S.; Freier, E.; Potschies, M.; Hofmann, E.; Gerwert, K. Angew. Chem., Int. Ed. 2010, 49, 6889.
(41)Mathias, G.; Marx, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104, 6980.
(42)Lanyi, J. K. A structural view of proton transport by bacteriorhodopsin. In Biophysical and Structural Aspects of Bioenergetics Wikström, M., Ed.; Royal Society of Chemistry, 2005, 227.
(43)Mukhopadhyay, A. K.; Bose, S.; Hendler, R. W. Biochemistry 1994, 33, 10889.
(44)Lanyi, J. K. J. Phys. Chem. B 2000, 104, 11441－11448.
(45)Hoffmann, M.; Wanko, M.; Strodel, P.; Köenig, P. H.; Frauenheim, T.; Schulten, K.; Thiel, W.; Tajkhorshid, E.; Elstner, M. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 10808.
(46)Gai, F.; Hasson, K. C.; McDonald, J. C.; Anfinrud, P. A. Science 1998, 279, 1886－1891.
(47)Lanyi, J. K. Annu. Rev. Physiol. 2004, 66, 665－688.
(48)Garczarek, F.; Gerwert, K. Nature (London, U. K.) 2006, 439, 109.
(49)Braiman, M. S.; Dioumaev, A. K.; Lewis, J. R. Biophys. J. 1996, 70, 939.
(50)Kühlbrandt, W. Nature (London) 2000, 406, 569.
(51)Luecke, H.; Schobert, B.; Richter, H.-T.; Cartailler, J.-P.; Lanyi, J. K. Science 1999, 286, 255.
(52)Spassov, V. Z.; Luecke, H.; Gerwert, K.; Bashford, D. J. Mol. Biol. 2001, 312, 203.
(53)Freier, E.; Wolf, S.; Gerwert, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011, 108, 11435.
(54)Sperling, W.; Carl, P.; Rafferty, C. N.; Dencher, N. A. Biophys. Struct. Mech. 1977, 3, 79.
(55)Wand, A.; Friedman, N.; Sheves, M.; Ruhman, S. J. Phys. Chem. B 2012, 116, 10444.
(56)Scherrer, P.; Mathew, M. K.; Sperling, W.; Stoeckenius, W. Biochemistry 1989, 28, 829.
(57)Kalisky, O.; Feitelson, J.; Ottolenghi, M. Biochemistry 1981, 20, 205.
(58)Gergely, C.; Zimányi, L.; Váró, G. J. Phys. Chem. B 1997, 101, 9390－9395.
(59)Bennett, J. A.; Birge, R. R. J. Chem. Phys. 1980, 73, 4234.
(60)Balashov, S. P.; Imasheva, E. S.; Govindjee, R.; Ebrey, T. G. Biophys. J. 1996, 70, 473－481.
(61)Mowery, P. C.; Lozier, R. H.; Chae, Q.; Tseng, Y.-W.; Taylor, M.; Stoeckenius, W. Biochemistry 1979, 18, 4100－4107.
(62)Becher, B.; Tokunaga, F.; Ebrey, T. G. Biochemistry 1978, 17, 2293.
(63)Lanyi, J. K. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1993, 1183, 241.
(64)Van, d. S. R.; Biesheuvel, P. L.; Mathies, R. A.; Lugtenburg, J. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 6410.
(65)Harbison, G. S.; Mulder, P. P. J.; Pardoen, H.; Lugtenburg, J.; Herzfeld, J.; Griffin, R. G. J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 4809.
(66)Wada, M.; Sakurai, M.; Inoue, Y.; Tamura, Y.; Watanabe, Y. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 1537.
(67)Kakitani, H.; Kakitani, T.; Rodman, H.; Honig, B. Photochem. Photobiol. 1985, 41, 471.
(68)Beppu, Y.; Kakitani, T. Photochem. Photobiol. 1994, 59, 660.
(69)Birge, R. R.; Murray, L. P.; Pierce, B. M.; Akita, H.; Balogh-Nair, V.; Findsen, L. A.; Nakanishi, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1985, 82, 4117.
(70)Baasov, T.; Friedman, N.; Sheves, M. Biochemistry 1987, 26, 3210.
(71)Hu, J.; Griffin, R. G.; Herzfeld, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91, 8880.
(72)Komrakov, A. Y.; Kaulen, A. D. Biophys. Chem. 1995, 56, 113－119.
(73)Shrager, R. I.; Hendler, R. W.; Bose, S. Eur. J. Biochem. 1995, 229, 589.
(74)Dancsházy, Z.; Tokaji, Z. Biophys. J. 1993, 65, 823.
(75)Hendler, R. W.; Dancsházy, Z.; Bose, S.; Shrager, R. I.; Tokaji, Z. Biochemistry 1994, 33, 4604.
(76)Luchian, T.; Tokaji, Z.; Dancsházy, Z. FEBS Lett. 1996, 386, 55－59.
(77)Mukhopadhay, A. K.; Bose, S.; Hendler, R. W. Biochemistry 1994, 33, 10889.
(78)Tallent, J. R.; Stuart, J. A.; Song, Q. W.; Schmidt, E. J.; Martin, C. H.; Birge, R. R. Biophys. J. 1998, 75, 1619.
(79)Ludmann, K.; Gergely, C.; Váró, G. Biophys. J. 1998, 75, 3110－3119.
(80)Richter, H.-T.; Brown, L. S.; Needleman, R.; Lanyi, J. K. Biochemistry 1996, 35, 4054.
(81)Váró, G.; Lanyi, J. K. Biophys. J. 1989, 56, 1143－1151.
(82)Subramaniam, S.; Marti, T.; Khorana, H. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990, 87, 1013－1017.
(83)Bressler, S.; Friedman, N.; Li, Q.; Ottolenghi, M.; Saha, C.; Sheves, M. Biochemistry 1999, 38, 2018.
(84)Zimányi, L.; Váró, G.; Chang, M.; Ni, B.; Needleman, R.; Lanyi, J. K. Biochemistry 1992, 31, 8535.
(85)Oesterhelt, D.; Hegemann, P.; Tittor, J. EMBO J. 1985, 4, 2351.
(86)Hurley, J. B.; Ebrey, T. G. Biophys. J. 1978, 22, 49.
(87)Oesterhelt, D.; Hess, B. Eur. J. Biochem. 1973, 37, 316.
(88)Birge, R. R. Biochim. Biophys. Acta 1990, 1016, 293.
(89)Kandori, H. Protein-controlled ultrafast photoisomerization in rhodopsin and bacteriorhodopsin. In supramolecular photochemistry : controlling photochemical processes; John Wiley & Sons, Inc., 2011, 571.
(90)Kim, J. E.; Tauber, M. J.; Mathies, R. A. Biochemistry 2001, 40, 13774－13778.
(91)Váró, G.; Needleman, R.; Lanyi, J. K. Biophys. J. 1996, 70, 461－467.
(92)Oesterhelt, D.; Stoeckenius, W. Methods Enzymol. 1974, 31, 667－678.
(93)Danon, A.; Brith-Lindner, M.; Caplan, S. R. Biophys. Struct. Mech. 1977, 3, 1.
(94)Ames, J. B.; Mathies, R. A. Biochemistry 1990, 29, 7181－7190.
(95)Váró, G.; Lanyi, J. K. Biochemistry 1991, 30, 5008－5015.
(96)http://www.oceanoptics.com/Products/benchoptions_usb4.asp.
(97)Moltke, S.; Heyn, M. P. Biophys. J. 1995, 69, 2066－2073.
(98)Lórenz-Fonfría, V. A.; Kandori, H. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 5891－5901.
(99)Polland, H. J.; Franz, M. A.; Zinth, W.; Kaiser, W.; Köelling, E.; Oesterhelt, D. Biophys. J. 1986, 49, 651.
(100)Birge, R. R.; Hubbard, L. M. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 2195－2205.
(101)Hasson, K. C.; Gai, F.; Anfinrud, P. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 15124－15129.
(102)Birge, R. R.; Zhang, C. F. J. Chem. Phys. 1990, 92, 7178－7195.
(103)Schenkl, S.; Portuondo, E.; Zgrablić, G.; Chergui, M.; Haacke, S.; Friedman, N.; Sheves, M. Phys. Chem. Chem. Phys. 2002, 4, 5020－5024