本研究之目的，在於利用電子顯微鏡取代解析度不足之光學顯微鏡作為觀察的工具，並配合微機電技術所製作的微型濕式腔體元件，將潮濕、液態的樣品封存於元件中藉此與電鏡的真空環境作隔絕，如此使得我們能夠在具高解析度電子顯微鏡下觀察於液體中的原生態細胞。
在背向散射電子成像模式的SEM中觀察上述樣品的影像，可發現液體(水)順利保留於元件中，然而存在於液體中的衣藻樣品卻無法在影像上觀察到，經過先將衣藻固定於觀測薄膜上之實驗後，發現水加入會對於影像的對比產生嚴重的負面影響，並從文獻中發現因為水與細胞在影像中細胞之於液體的對比只有2.7%而無法呈現，為解決此問題，使用對細胞相對毒性較低的甘油取代水可能是一解決的方式。
而在TEM的影像中所能帶給我們的資訊相當有限，這可能是由於覆蓋於細胞上方的液體使得電子束直徑擴展，以及細胞厚度過厚(≈5μm)使電子束產生大量散射行為，因而無法獲得良好的解析度，有鑒於此我們藉由反應式離子蝕刻與纖維素分解酶兩種方式將細胞進行薄化的動作，然而在效果仍不顯著的情況下或許利用外力將細胞壓扁將是一可嘗試的作法。

Abstract

In this paper, the wet-cell which was manufactured by MEMS processes is used for isolating the hydrated, liquid sample from the vacuum environmental of electron microscope. Thus we can observe the native state cell under the electron microscopes which have much higher resolution than optical microscope.
Through the images of the above sample which obtained by a BSE mode SEM, we can confirm the liquid is sealed in the wet-cell. However, the image of Chlamydomonas reinhardtii cannot be observed and after the test of attaching cell to the thin film, we understand that the contrast between water and cell are too low to appear. A solution for solving this problem is that replace the water by glycerine to enhance the contrast of image.
On the other hand, the images which acquired from TEM bring limited information. This may result from the electron beam broadening by liquid, besides thick cell cause large amount scattering therefore high resolution can’t be achieved. On that account we use reactive-ion etching and cellulase enzymes to thin the cell, however the effect is not apparent. By means of mechanical force to compress the cell may be a method to improve this problem.

摘要……………………………………………………………………..Ⅰ
Abstract………………………………………………………………….Ⅱ
致謝……………………………………………………………………..Ⅲ
目錄……………………………………………………………………..Ⅳ
圖目錄…………………………………………………………………..Ⅵ
第一章 前言……………………………………………………………..9
1.1 顯微鏡的發展…………………………………………………..9
1.2 電子顯微鏡應用於生物樣品的限制…………………………11
1.3 研究動機與目標………………………………………………12
第二章 文獻回顧………………………………………………………13
2.1 早期電鏡對綠藻顯微結構的研究……………………………13
2.2 環境式電子顯微鏡的發展……………………………………16
2.3 微型及流體環境腔體元件……………………………………21
2.4 照光系統於電子顯微鏡的應用………………………………33
第三章 實驗方法………………………………………………………35
3.1 材料與設備……………………………………………………35
3.1.1 Wet-cell材料與微機電製程設備………………………..35
3.1.2 觀察與量測儀器………………………………………..36
3.1.3 流體系統電子顯微鏡裝置……………………………..37
3.1.4 衣藻培養液配方………………………………………..38
3.2 Wet-cell元件結構與製程…………………………………………..39
3.3 衣藻細胞培養……………………………………………………...42
3.4 樣品封裝與流體循環系統………………………………………...43
第四章 結果與討論……………………………………………………46
4.1 衣藻細胞於OM與乾燥狀態下EM之觀測………………….46
4.1.1 衣藻細胞於OM下之觀測……………………………..46
4.1.2 乾燥衣藻細胞樣品於SEM之觀測……………………47
4.1.3 乾燥衣藻細胞樣品於TEM之觀測……………………50
4.1.4 厚度減薄衣藻細胞樣品於EM之觀測………………...53
4.2 濕式衣藻細胞樣品於EM下之觀測………………………….55
4.2.1 濕式衣藻細胞於SEM下之觀測……………………….55
4.2.2 流體循環系統於SEM中之觀測……………………….59
4.2.3 流體循環系統於SEM中之觀測……………………….65
第五章 結論……………………………………………………………68
參考文獻………………………………………………………………..69

圖目錄

圖 2- 1 衣藻鞭毛超薄切片電子顯微鏡影像………13
圖 2- 2 (A)相位對比OM下細胞壁的影像 (B)細胞壁於TEM下之影像X60K…14
圖 2- 3 (A)衣藻超薄切片之電鏡影像 (B) ZYGOTE WALL區的細微結構……15
圖 2- 4 早期孔隙侷限型環境腔體裝置結構圖………17
圖 2- 5 早期薄膜侷限型環境腔體裝置結構圖………17
圖 2- 6 (A)銅網上長出的針狀結晶 (B)針狀結晶經過30分鐘還原反應之形貌 ………18
圖 2- 7 (A)浸沒在薄水層中的大腸菌群 (B) 培養在金網上的3T3纖維母細胞 ………19
圖 2- 8 (A)潮濕態的矽酸鹽顆粒 (B)乾燥後出現類裂痕條紋的矽酸鹽顆粒 …20
圖 2- 9最早微型環境腔體元件 (A)氮化矽視窗 (B)液體填充完之樣品………21
圖 2- 10 (A)自我對準機制(B)樣品封填流程(C)元件於電子顯微鏡中觀測之示意 ………22
圖 2- 11 (A)耐輻射奇異球菌之TEM影像(B)細胞經電子束福照射仍具分裂能力 ………23
圖 2- 12(A)流體抽換之微型環境腔FLOW CELL(B)FLOW CELL STEM運作示意圖 ………24
圖 2- 13 未脫水纖維母細胞之STEM影像………25
圖 2- 14 酵母菌樣品於LIQUID STEM運作方式示意圖………26
圖 2- 15 (A) 酵母菌相位對比OM 下之影像 (B)酵母菌經染色後的螢光影像(C) 浸沒在薄水層中的大腸菌………27
圖 2- 16 氣體循環的FLOW CELL剖面結構示意圖………28
圖 2- 17 (A)(B)氣體循環FLOW CELL組裝及氣體循環示意圖 (C)奈米金顆粒於常壓………29
圖 2- 18 各種濃度下PBS奈米顆粒不同的成長模式………30
圖 2- 19 PBS奈米顆粒成長速率影像與時間關係圖………31
圖 2- 20反應物中不同硫與鉛比例對奈米顆粒外觀形狀的影響………32
圖 2- 21 氧化銅顆粒反應前後之影像、選區繞射圖形、EELS氧化態分析……34


圖 3-1 FLOW WET-CELL金屬轉接盒與流體線路………37
圖 3-2 SEM流體法蘭………37
圖 3- 3(A) OUT-FRAME結構示意圖 (B)IN-FRAME結構示意圖………39
圖 3- 4 SAW CELL組裝示意圖 ………39
圖 3- 5 (A)OUT-FRAME製作流程(B) IN-FRAME製作流程………41
圖 3- 6 (A) 控溫控光之培養箱 (B) 旋轉平台SHAKER………42
圖 3- 7 (A)PDMS SPACER WET-CELL組裝示意 (B)組裝完成之PDMS SPACER WET-CELL………43
圖 3- 8 FLOW WET-CELL金屬轉接盒與晶片之組合示意圖………44
圖 3- 9 完整FLOW WET-CELL系統於SEM腔體中之示意圖………45


圖 4- 1 各倍率衣藻光學顯微鏡影像………46
圖 4- 2 WET-CELL中衣藻樣品仍具活動性之變化………46
圖 4- 3 乾燥衣藻樣品製備示意圖………47
圖 4- 4 (A)滴入OUT-FRAME經固定、脫水處理之衣藻樣品×100 (B) ×250 ………48
圖4- 5 (A)與圖4-4OM對應位置之SEM影像………48
圖 4- 6 (A) ~(D)經固定脫水處理衣藻樣品之TEM影像, (B)~(D) ×2000 ………50
圖 4- 7 (A)(B)完全脫水之衣藻TEM影像 (C)(D)衣藻切片與胞器結構圖…52
圖 4- 8 (A)60秒 (B)180秒 (C)300秒RIE衣藻試片………53
圖 4- 9 (A)~(C)RIE薄化處理SEM衣藻影 (D)~(F) RIE薄化處理TEM衣藻影像 ………54
圖 4- 10 濕式衣藻樣品封存示意圖………55
圖 4- 11濕式樣品相對應之OM及SEM之影像………56
圖 4- 12 衣藻細胞距離晶片窗口薄膜過遠而無法成像………56
圖 4- 13 衣藻(未固定脫水)貼附於薄膜之SEM影像………57
圖 4- 14衣藻(未固定脫水)貼附於薄膜之SEI SEM影像………57
圖 4- 15 液體加入WET-CELL(A)與未加入前(B)之影像比較………58
圖 4- 16 流體注入環境腔體之SEM 影像………59
圖 4- 17 背向散射係數與影像對比表示式 ………60
圖 4- 18 奈米金球與水在不同能量之電子束照射下分別對應之背向散射係數 ………61
圖 4- 19 背向散射係數與原子序相關曲線 ………62
圖 4- 20 甘油完全取代培養液樣品之SEM影像………63
圖 4- 21 50%甘油混合50%培養液樣品之SEM影像………64
圖 4- 22 潮濕狀態之衣藻細胞樣品………65
圖 4- 23 潮濕狀態衣藻細胞之TEM影像………66
圖 4- 24 潮濕態樣品中液體受電子束輻照產生之氣泡成長動態影像截圖……66
圖 4- 25 LIQUID STATE衣藻樣品之TEM影像………67

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