不同溫度下蛋白質結構會產生改變並影響其功能，且錯誤的折疊常會導致疾病產生，因此蛋白質折疊以及去摺疊現象成為重要的研究課題。其中溫度躍升實驗為廣泛使用的研究方法。以往溫度躍升實驗搭配螢光偵測的儀器架設，可能會有加熱不均勻的問題，使偵測系統接收到處於不同溫度下的樣品螢光訊號。吾人將改良溫度躍升實驗偵測系統，並觀察牛血清白蛋白的去摺疊現象。在溫度躍升實驗偵測系統中引入共軛焦設置，偵測約10–3 mm3微小體積中的溫度時間側寫，並提供100 μm的空間解析度。以1064 nm脈衝雷射(脈衝寬度約100 μs)激發二氧化矽包覆之金奈米棒(AuNR@SiO2)光熱轉換，並由色胺酸螢光作為溫度計得知溫度躍升幅度可達5 °C。此外，亦使用1550 nm連續波雷射激發水分子，提升樣品至44 °C作為研究牛血清白蛋白去摺疊現象時的起始溫度。於44 °C時的螢光下降比例的時間側寫與室溫下相異，其中包含去摺疊過程的資訊，藉單指數擬合得到75 ± 15 s–1之速率常數。本篇論文證實以二氧化矽包覆之金奈米棒作為溫度躍升實驗光熱轉換材料的可行性，並架設空間暨時間解析溫度躍升螢光系統偵測微小體積內的螢光變化。此系統亦可藉由更換物鏡以及濾波片，作為研究不同蛋白質去摺疊現象的新方法。

The function of proteins strongly depends on their conformations, which alters with the temperatures. Misfolding and aggregation might lead to numerous diseases. Particular attention thus has been given to protein folding and unfolding kinetics in numerous researches. Among miscellaneous relaxation approaches of protein kinetics, temperature jump is frequently used to initiate the protein conformational change. In this work, a confocal fluorescent thermometer was developed to detect the temperature evolution in a small excitation volume of ca. 10–3 mm3 and provide a spatial resolution of 100 μm. Photoexcitation of SiO2-coated gold nanorods (AuNR@SiO2) with a 1,064 nm pulse of ca. 100 μs duration leads to a temperature jump of 5 °C, as determined by the evolution of the fluorescence intensity of tryptophan. In addition, a continuous-wave laser at 1,550 nm was employed to increase the initial temperature to 44 °C by heating H2O, providing alternative initial temperatures for temperature jump experiments to reveal the unfolding kinetics of bovine serum albumin (BSA). The evolution of fluorescence of BSA upon temperature jump when the stationary temperature was raised to 44 °C differed from that at room temperature, suggesting a dynamical unfolding kinetics, and a rate coefficient of 75 ± 15 s–1 was derived. In this work, we successfully demonstrated the applicability of AuNR@SiO2 as the photothermal material for the temperature jump and employment of a confocal fluorescent thermometer to precisely monitor the minuscule heating volume. It would be advantageous to utilize this apparatus as an alternative tool for studying the kinetics of protein unfolding.

目錄
第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 文獻回顧 1
1.2.1 溫度躍升法 1
1.2.2 金奈米棒光熱效應之應用 2
1.3 實驗動機與目的 2
1.4 共軛焦顯微成像技術 3
1.5 金奈米棒之光譜性質 3
1.5.1 侷域性表面電漿共振 3
1.5.2 光熱效應 5
1.6 色胺酸的螢光特性 6
1.6.1 色胺酸螢光機制 6
1.6.2 色胺酸螢光強度與溫度的相依性 7
1.6.3 蛋白質中的色胺酸螢光 7
1.7 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 8
1.7.1 牛血清白蛋白的結構 8
1.7.2 去摺疊現象之相關研究 8
第二章 實驗儀器與架設 31
2.1 實驗儀器原理介紹 31
2.1.1 吸收光譜 31
2.1.2 圓二色光譜(circular dichroism spectroscopy，CD) 32
2.1.3 靜態螢光光譜 34
2.1.4 穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM) 35
2.2 空間暨時間解析溫度躍升螢光系統 36
第三章 樣品製備與實驗步驟 47
3.1 金奈米棒合成、修飾以及純化 47
3.1.1 金奈米棒合成 47
3.1.2 二氧化矽包覆之金奈米棒 48
3.1.3 實驗藥品 49
3.2 樣品定性 49
3.2.1 調整金奈米棒長寬比 49
3.2.2 離心純化後的金奈米棒形貌 49
3.3 光譜偵測 50
3.3.1 吸收光譜儀 50
3.3.2 圓二色光譜儀 50
3.3.3 靜態螢光光譜儀 50
3.3.4 穿透式電子顯微鏡 51
3.3.5 空間及時間解析溫度躍升螢光系統 51
第四章 實驗結果與討論 59
4.1 利用色胺酸作為螢光溫度計 59
4.1.1 色胺酸螢光與溫度變化的相依性 59
4.1.2 將螢光強度時間側寫轉換為溫度躍升時間側寫 59
4.2 色胺酸之溫度躍升時間側寫 60
4.2.1 溫度躍升來源與1064 nm脈衝雷射能量之相依性 60
4.2.2 系統之空間解析能力 60
4.2.3 調節溫度躍升幅度 61
4.2.4 AuNR@SiO2對1064 nm脈衝雷射之耐受度 62
4.3 以1550 nm連續波雷射提升樣品初始溫度 62
4.4 牛血清白蛋白之去摺疊動力學 63
4.4.1 牛血清白蛋白與AuNR@SiO2間的相互作用 63
4.4.2 不同溫度下牛血清白蛋白的靜態螢光光譜 64
4.4.3 牛血清白蛋白之溫度躍升實驗 64
第五章 結論 80

 
圖目錄
第一章
圖 1-1 近紅外窗口波長示意圖 10
圖 1-2 溫度躍升實驗中，近紅外光激發光源與紫外光偵測光源能量分布圖 11
圖 1-3 共軛焦螢光顯微鏡架設圖，偵測器僅接收來自焦點的螢光訊號 12
圖 1-4 金屬奈米粒子的侷域性表面電漿共振 13
圖 1-5 金奈米棒長軸、短軸的侷域性表面電漿共振以及吸收光譜 14
圖 1-6 模擬金奈米棒在不同長寬比以及介質中的吸收光譜 15
圖 1-7 金奈米粒子經脈衝雷射激發後的熱緩解過程之時序圖 16
圖 1-8 色胺酸分子結構、吸收光譜與螢光放光光譜 17
圖 1-9 色胺酸的能量緩解機制 18
圖 1-10 溫度上升幅度與色胺酸與酪胺酸螢光下降比例的關係 19
圖 1-11 色胺酸在pH=7和11時，各緩解途徑的量子產率 20
圖 1-12 牛血清白蛋白的結構 21
第二章
圖 2-1 電子能階及其躍遷示意圖 38
圖 2-2 自組裝式紫外/可見光吸收光譜儀及內部構造 39
圖 2-3 物質不同的左旋光及右旋光吸收程度，造成不同種的偏振光 40
圖 2-4 多胜肽鍵的電子躍遷及不同二級結構之圓二色光譜 41
圖 2-5 受激發分子的能量緩解途徑 42
圖 2-6 穿透式電子顯微鏡的構造圖 43
圖 2-7 空間暨時間解析溫度躍升螢光系統架設圖 44
第三章
圖 3-1 加入不同對苯二酚水溶液濃度，所合成出的金奈米棒之吸收光譜 52
圖 3-2 不同表面物質的金奈米棒純化前後之電子顯微影像 53
圖 3-3 不同表面物質的金奈米棒純化前後之吸收光譜 54
第四章
圖 4-1 色胺酸混合溶液在不同溫度的靜態螢光光譜及其相對於25 ℃的螢光強度下降比率與升高溫之關係 66
圖 4-2 將螢光強度時間側寫轉換為溫度躍升時間側寫 67
圖 4-3 色胺酸混合溶液溫度躍升與脈衝雷射之關係 68
圖 4-4 色胺酸混合溶液中沿Z軸方向掃描不同位置的溫度躍升時間側寫之二維等溫線圖，及不同偵測位置與最高溫度躍升幅度的關係 69
圖 4-5 色胺酸混合溶液於不同AuNR@SiO2濃度及1064 nm脈衝雷射能量的溫度躍升時間側寫與最高溫度躍升幅度 70
圖 4-6 不同光源照射下的AuNR@SiO2電子顯微影像以及吸收光譜 71
圖 4-7 以1550 nm連續波雷射提升色胺酸混合溶液初始溫度時的溫度變化時間側寫 72
圖 4-8 牛血清白蛋白在有無混合AuNR@SiO2下的吸收光譜以及圓二色光譜 73
圖 4-9 牛血清白蛋白混合溶液在不同溫度下的靜態螢光光譜及螢光波峰位置 74
圖 4-10 不同初始溫度下牛血清白蛋白混合溶液之螢光下降比例時間側寫及初始溫度在44與26 ℃之規一化螢光下降比例時間側寫的比值 75
圖 4-11 牛血清白蛋白混合溶液於不同初始溫度經溫度躍升實驗前後的圓二色光譜 76
第五章
圖 5-1 牛血清白蛋白溫度躍升實驗的概念與結果圖 80


表目錄
第一章
表 1-1雷射經不同氣體拉曼轉換後之波長與相對應之吸收度 22
表 1- 2色胺酸、酪胺酸以及苯丙胺酸的消光係數及螢光量子產率 22
第二章
表 2-1 不同種類電子躍遷所對應到的波長區間以及官能基 45
第三章
表 3-1 實驗藥品 55
表 3-2 圓二色光譜儀參數之設定 56
表 3-3 靜態螢光光譜偵測之混合溶液中各成分的濃度 56
表 3-4 靜態螢光光譜儀參數之設定 56
表 3-5 溫度躍升螢光系統偵測之混合溶液中各成分的濃度 57
表 3-6 溫度躍升螢光系統不變的參數設定 57
表 3-7 擷取不同時域的溫度變化時間側寫之儀器參數設定 57
第四章
表 4-1 AuNR@SiO2的電子顯微影像統計結果 77

第一章
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