流式細胞儀是利用光照射細菌，來檢測細菌的光基因電路表現的標準方法，但是它必須先在外部誘發基因，再放進儀器中偵測基因表現，是需要耗費較多人力成本，而且實驗上也較為繁瑣。在本研究中，我們設計了一個工作體積約10ml的閃爍計數瓶的生物反應器，能夠即時偵測CCaS-CCaR光感測系統的基因表現。報導基因蛋白的光密度、螢光蛋白偵測和誘導基因的光源，由四個發光二極體和兩個光電晶體組成。經過市售偵測儀器校正之後，此實驗裝置能夠自動化操作，同時做細菌培養並記錄其生長和基因表現，不需要額外的人力操作。我們做了用不同有機物(葡萄糖、琥珀酸鹽、乙酸鹽和丙酮酸鹽)作為基本培養基的碳來源實驗，觀察其細菌生長的基因表達。還有透過連續稀釋步驟證明光基因電路調變的演化實驗。

Current standard protocol to characterize such optogenetic circuit of bacterial cells using flow cytometry in light tubes and well plates for light exposure is tedious, labor intensive and cumbersome. In this work, we engineer a bioreactor of working volume ~10 ml for in vivo, real time optogenetic characterization of E. coli with a CCaS-CCaR light sensing system. The optical density, fluorescence detection for reporter protein as well as the light input stimuli are provided by four light emitting diode sources and two photodetectors. Once calibrated, the device can cultivate the cells and record both the microbial growth and gene expression without human intervention. We measure gene expression for cell growth under different organic substrates(glucose, succinate, acetate, and pyruvate) as carbon source in minimal medium and demonstrate evolutionary tuning of optogenetic circuit by serial dilution passage.

目錄
誌謝 I
中文摘要 II
Abstract III
目錄 IV
圖目錄 VI
表目錄 VIII
一、緒論 1
1-1研究動機 1
1-2文獻回顧 3
1-2-1光基因電路的建構 3
1-2-2基因表現的檢測 5
1-2-3在不同培養基下的細菌生長 7
二、材料及方法 8
2-1製作感光大腸桿菌樣本 8
2-1-1 質體轉型 8
2-1-2 質體DNA萃取 10
2-1-3 電泳分析 12
2-2藥品配製 13
2-2-1 M9營養液配方 13
2-2-2抗生素配方 14
2-3系統架設 15
2-3-1 硬體架設 15
2-3-2 光感測生物反應器製作 18
2-3-3 自製攪拌系統 22
2-3-4 無線傳輸系統 23
2-3-5 升壓系統 25
2-3-6 Arduino程式編譯 26
2-4校正系統電壓 27
2-5光學量測方法 30
三、實驗結果 31
3-1實驗前準備步驟 31
3-2實驗步驟 32
3-2-1 大腸桿菌在不同碳來源培養基下的生長 32
3-2-2 大腸桿菌演化實驗 33
3-2-3 大腸桿菌在無氧環境下的生長 35
3-3培養結果 36
3-3-1大腸桿菌在不同碳來源培養基下的生長 36
3-3-2大腸桿菌演化實驗 39
3-3-3 大腸桿菌在無氧環境下的生長 43
四、結論及討論 44
附錄 46
A-1 Arduino 程式碼 46
A-5 生物反應器與壓克力盒設計圖 53
參考文獻 58

圖目錄
圖1-1. 光基因電路示意圖　(本圖擷取自參考文獻[5]) 4
圖1-2. 光切換造成基因表現的開關　(本圖擷取自參考文獻[19]) 4
圖1-3. 測量光密度系統　(本圖擷取自參考文獻[14]) 6
圖1-4. 兩種光切換的曝光陣列系統 (本圖擷取自參考文獻[19]) 6
圖1-5. 光密度與螢光的偵測系統 (本圖擷取自參考文獻[16]) 6
圖2-1. 質體轉型成果 9
圖2-2. 質體轉型成果 15
圖2-3. 系統實體圖 16
圖2-4. (a)發光二極體(940nm)偏壓電路 (b)光電晶體偏壓電路 19
圖2-5. (a)發光二極體(470nm)偏壓電路 (b)光電晶體偏壓電路 19
圖2-6. (a)發光二極體及電晶體轉接頭 (b)光學濾片轉接頭 (c)90度角螢光偵測模組 (d)135度角光密度偵測模組 (e) LED燈條裝載示意圖 21
圖2-7. (a)磁石攪拌器(b)達靈頓電路晶片 22
圖2-8. NRF24L01+無線收發模組 23
圖2-9. 發送與接收微控制器 24
圖2-10. 升壓模組 25
圖2-11. Arduino編譯程式與讀取介面 26
圖2-12. 電壓值與OD值校正 28
圖2-13. 電壓值與GFP值校正 28
圖2-14. PWM與綠光功率校正 29
圖2-15. PWM與紅光功率校正 29
圖2-16. 光學量測位置示意圖 30
圖3-1. 大腸桿菌預養示意圖 31
圖3-2. 大腸桿菌演化實驗示意圖 34
圖3-3. 大腸桿菌在暗室和綠光下的實驗流程圖 34
圖3-4. 無氧系統示意圖 35
圖3-5. 綠光條件下的大腸桿菌OD對時間 37
圖3-6. 綠光條件下的大腸桿菌GFP對時間 38
圖3-7. 綠光條件下的大腸桿菌GFP/OD對時間 38
圖3-8. 綠光條件下的大腸桿菌生長速率對時間 40
圖3-9. 綠光條件下的大腸桿菌基因表現對時間 41
圖3-10. 綠光條件下的大腸桿菌GFP/OD對生長速率 41
圖3-11. 綠光和暗室條件下基因表現的誤差比率 42
圖3-12. 大腸桿菌在有氧和無氧環境下的OD對時間 43
圖4-1. 藻類裝置實體圖 45

表目錄
表2-1. 系統零件表 17
表2-2. NRF24L01+與Arduino Mega2560的相對腳位連接 24
表3-1. 四種碳源培養基在綠光和暗室條件下的大腸桿菌生長速率比較 37

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